Molekularbiologie Experimente

Frederic Griffith

was ist Träger der Erbinformation?

Versuch mit Mäusen & Erreger der Lungenentzündung

1. Mäuse mit Erreger für Lungenerkrankung infizieren

smooth-type → intakt, virulent

rough-type → intakt, nicht-virulent

hitze-inaktivierter smooth-type → inaktiv, virulent

2. Co-Injektion von r-type & inaktivem s-type

→ Erreger wieder virulent

3. selektiv einzelne Komponenten inaktivieren (RNA, Protein, Zellmembran, DNA) bis r-typ bei Co-Injektion nicht mehr in s-typ übergeht

→als DNA inaktiviert, Co-Injektion nicht mehr ✝︎

Hershey & Chase

Was ist Träger der Erbinformation?

Versuch mit Bakterien, Phagen & radioaktiven Isotopen (Phosphor: P³² & Schwefel: S³⁵).

Muss DNA & Proteine markieren mit Radioaktivität (DNA mit P³², Proteine mit S³⁵):

1. Bakteriophagen (Viren aus DNA & Protein) radioaktiv markieren: Inkubieren in Schale mit Bakterien & Isotopen

2. Phagen infizieren Bakterien & bauen dabei Isotope in eigene Bestandteile ein

3. Bakterien platzen lassen, Phagen werden frei

→ habe jetzt radioaktiv-markierte Phagen

4. Phagen auf jeweils frische Bakterienkultur geben & Bakterien infizieren lassen

5. bevor sie platzen Bakterien abzentrifugieren & Radioaktivität messen

→ bei P³² mehr Radioaktivität in den Bakterien, also wurde DNA übertragen (bei S³⁵ mehr in Schale bei Phagen zurückgeblieben, also Proteine nicht übertragen)

Beadle & Tatum

Was ist ein Gen?

Versuch mit haploiden Pilzen (= ein Chromosomensatz, Mutation schlägt sich sofort in Phänotyp nieder) & Mutagenese (hier radioaktive Strahlung).

1. Pilze mutagenisieren → zufällige Mutationen

2. in Vollmedium kultivieren (alle 20 AS da)

→ die, mit letalen Mutationen sind nicht gewachsen, Rest konnte zwar wachsen aber hat wahrscheinlich viele Mutationen

3. WACHSTUMSFÄHIGE Kulturen in Minimalmedium (keine AS mehr, können Pilze eigentlich alle selbst herstellen)

→ einige konnten nicht mehr wachsen (also nicht mehr alle AS herstellen)

4. NICHT wachstumsfähige Kulturen auf 20 Medien, denen jeweils eine AS fehlt (jede einzeln testen) → konnte z.B. nicht mehr Lysin selbst herstellen

→ ein Gen (welches ja bei Mutagenese verändert wurde) codiert für ein Enzym ABER heute weiß man, dass ein Gen nicht nur für Enzyme codiert

Meselson & Stahl

Wie wird DNA repliziert?

Versuch mit nicht radioaktiven Stickstoff-Isotopen (N¹⁴ & N¹⁵) & Bakterien

konnte überlegen, entweder:

I. Konservativ: Mutterstränge bleibt zusammen & 2 neue Tochterstränge

II. Dispersiv: Mutterstränge wird zufällig auf Tochterstränge verteilt

III. Semikonservativ: jeder Mutterstrang bekommt einen neuen Tochterstrang

1. Bakterien in N¹⁵ haltigem Medium kultivieren

2. in N¹⁴ haltiges Medium überführen für EINEN Zellzyklus

3. DNA aufreinigen, abzentrifugieren in Cäsiumchloridlösung

→ eine Bande, also entweder dispersiv oder semikonservativ (bei konservativ hätten es 2 Banden sein müssen, da N¹⁵-haltige dsDNA schwerer als N¹⁴-haltige)

4. Versuch wiederholen aber jetzt für ZWEI Zyklen in N¹⁴

5. DNA wieder aufreinigen & abzentrifugieren

→ zwei Banden, also semikonservativ (bei dispersiv hätte immer noch nur eine Bande sein dürfen).

2 Banden, weil:

1. Zyklus: vorher N¹⁵, also Mutterstrang, nur N¹⁵, dann in N¹⁴ → jeder Mutterstrang bekommt einen leichteren Tochterstrang (sind immer noch gleich schwer, deshalb nur eine Bande beim ersten abzentrifugieren).

2. Zyklus: wieder in N¹⁴ → habe einen Strang aus halb N¹⁵/halb N¹⁴ (von vorhin) & neuen Strang. Ist nur N¹⁴/N¹⁴, also leichter & man sieht zwei Banden.

DNA abzentrifugieren Lösung

in wässiger Lösung. DNA aber höhere Dichte als Wasser (1,7) → um anzugleichen Cäsiumchlorid verwenden. DNA positioniert sich beim abzentrifugieren dann entsprechend ihrer Dichte.

Anfärben mit Ethidiumbromid

Pulse-Chase-Experiment

wie wird Replikation bei Eukarya reguliert?

1. Zellen synchronisieren (kultivieren bis man weiß, dass in S-Phase (dort wird DNA repliziert)

2. Pulse: Zellen Tritium-markierte Nukleotide anbieten → werden eingebaut

3. Überschüssige Nukleotide wegwaschen

4. warten, bis Zelle in M-Phase & platzen lassen

5. Chase: Autoradiogramm. Sieht, wo eingebaut wird.

OriC (Replikationsstart) finden

Sequenz finden, dessen Funktion bereits bekannt.

1. Hefe-DNA zufällig fragmentieren

2. Fragmente zufällig in Plasmide einbauen (haben zusätzlich HIS-Gen)

→ Plasmid repliziert nur, wenn zufällig ARS (autonom replizierende Sequenz) eingebaut

3. Plasmid in Hefezellen einbauen (ihnen fehlt HIS)

→ nur Hefezellen mit ARS-Plasmid können auf selektivem Medium wachsen, da sich nur Plasmide mit ARS replizieren & Hefe Enzym für Medium braucht

4. Hefen auf selektivem Medium kultivieren

5. Plasmid aus überlebenden Hefen herausholen & unbekannte Sequenz sequenzieren