How to get DNA

I DNA binder G till C (G-C) och A till T (A-T). Vilken av dessa par binder till varandra starkast

G-C har 3 vätebindningar

A-T har 2 vätebindningar

Därför har G-C starkare bindning och därmed är en DNA-region med mycket G-C svårare att klyva. Det kräver högre energi/temperatur att separera strängarna

Hur kan vätebindningar mellan basparen bli starkare?

Med hjälp av vissa metalljoner som t.ex Mg²⁺

Åt vilket håll syntetiseras DNA

Åt 5’ → 3’. Detta för att 3’-kolet har en en OH-grupp som deltar i reaktionen där en ny nukleotid binder in. OH reagerar med fosfat som sitter på 5’-kolet på den nya nukleotiden.

Vad är en vektor

En DNA-molekyl som används för att transportera en specifik DNA-fragment. Oftast används plasmider eller bakteriofager (virus) som vektor

Om man ska använda virus som vektor, var på dess DNA ska man integrera genen/DNA-fragmentet

I b2-regionen för att det är den regionen på dess DNA som inte är essentiell för kloning. Resten är regioner som innehåller sekvens för proteiner som är nödvändiga för infektion

Vad är rekombinant DNA

Det är den nya DNA-molekylen som består av vektor + den tillsatta DNA-fragmenten

Varför vill man klona DNA

För att kunna isolera en specifik DNA-fragment som ska studeras

Hur extraheras en gen från en kromosom

Två metoder:

1. DNA klyvs i sina gener och de introduceras till vektorer → separerar sedan vektorn med målgenen från resten

2. Om man vet gensekvensen så kan man använda primers → då kan man replikera målgenen direkt mha PCR

Beskriv de generella stegen för DNA-upprening från

1. Odling av bakteriekultur där cellerna sedan separeras (centrifugering)

2. Cellerna bryts som ger en cellösning (cell extract)

3. DNA renas upp från cellösningen

4. DNA koncentreras

Hur gör man en cellösning (cell extract)

1. Cellväggen och cellmembranet ska brytas ned → cellösning

2. Sedan centrifugeras cellösningen för att få endast DNA, RNA och proteiner

Hur får man ut DNA från cellösningen

Två vägar:

A) De kontaminerande ämnena bryts ned

B) DNA separeras från de kontaminerande ämnena

Beskriv användningen av fenol-kloroform för nedbrytning av kontaminerande ämnen när DNA ska isoleras från cellösningen

• De denaturerar proteiner i cellösningen

• Delar upp cellösningen i lager:

  • Översta lagret med DNA/RNA

  • Ett lager med denaturerade proteiner

  • Längst ner fenol

• Fenol är dock väldigt giftigt

Hur isolerar man DNA från kontaminerande ämnen i en cellösning mha etanol?

• Tillsats av salter som neutraliserar DNA:s negativa laddning och möjliggör utfällning

• När etanol tillsätts i cellösningen minskar DNA:s löslighet i vatten genom att den stör vattenstrukturen runt DNA

• Vid centrifugering fälls DNA sedan ut och hamnar i pelleten

Hur fungerar DNA-isolering mha silikonpartiklar

Cellösningen får åka igenom en kolumn som innehåller guanidinium tiocyanat och silikonpartiklar. Guanidinium tiocyanat denaturerar proteiner som då bara elueras ut. DNA däremot som är negativt laddad fastnar i kolumnen genom att de binder till de positivt laddade silikonpartiklarna. Vid tillsats av vatten eller salt kan DNA sedan elueras från kolumnen

Vad är poleras chain reaction (PCR)

Det är en metod för att syntetiseras en specifik DNA-sekvens flera gånger och mha det isolera den specifika sekvensen från resten av DNA-molekylen

Vad behövs det för att kopiera en DNA-sekvens i tub?

• Mall (template): DNA-sekvensen som ska kopieras

• Polymeras: den ska vara termostabil; t.ex Taq

• Nukleotider: dATP, dCTP, dGTP, dTTP (basparer)

• Primers: vägleder polymeras på vart den ska syntetisera

• Rätt miljö: temperatur, pH och saltkoncentration

Primers är en viktig komponent i PCR. Beskriv de.

• De definierar sekvensen som ska kopieras till polymeras

• Primers konstrueras efter den specifika DNA-sekvensen som man vill kopiera

• Primers konstrueras även efter hur man vill använda sekvensen sen

Beskriv “thermocycling” (temperaturjustering) under PCR

1. Denaturation: Temp. höjs till ungefär 95°C för att bryta vätebindningarna mellan dsDNA så att DNA-molekylen blir till ssDNA

2. Annealing: Temp. sänks till under smältpunkten av primersen (ca 45-60°C) så att primer kan binda in till ssDNA

3. Extension: Temp. höjs till DNA-polymerasets optimala aktivitet vilket är lite över 70°C s → poleras kopierar från mallen

Genom att justera temperaturen på detta sätt kan dessa tre processer sättas igång automatiskt i tuben.

Under PCR produceras inte målsekvensen förrän de tre första cyklarna. Beskriv de tre första cyklarna.

1. Efter denaturerar av dsDNA binder primersen in på 3’-änden av DNA-sekvensen för att DNA-polymeras syntetiserar 5’→3’. Produkten av första cykeln kommer inte vara den specifika sekvensen för att DNA-polymeras kommer att kopiera hela DNA men 5’ på den nya stängen börjar iallafall från 3’-änden av mallen

2. Vid andra cykeln binder primern igen vid 3’-änden fast på produkten från 1:a cykeln. Polymeras börjar då att syntetisera tills strängmallen tar slut vilket är vid dess 5’. Produkten blir då målsekvensen

3. Vid denna cykeln börjar syntesen av målsekvensen.

Vad ska man tänka på när man konstruerar primers?

• Att båda primersen (en för varje ssDNA 5’→3’ och 3’→5’) ska vara i motsatt riktning

• Båda primersen ska ha ungefär lika smältningpunkter annars kan den ena binda in senare än den andra → ineffektiv

• De måste vara tillräckligt långa för att öka specificiteten för DNA-sekvensen

• Men de ska inte heller vara för långa för att annars tar deras inbindning för lång tid

• Undvik komplementaritet både inom och mellan primersen. Komplementaritet mellan primersen leder till att de binder till varandra istället för DNA-strängen. Komplementaritet inom primern leder till att de bildar hårnålar vilket hindrar de från att binda till DNA

Vad har primers smältpunkt för påverkan på dess inbindning till DNA-strängen

• Temp mycket lägre än Tm: primers kan binda ospecifikt

• Temp lite lägre än Tm: primers binder till DNA-strängen med lite mismatch

• Temp högre: bildning av mismatch förhindras

• Temp för högt: primer binder aldrig → ingen PCR

Den optimala temperaturen för inbindning har empiriskt bestämts till 1-2 °C lägre än Tm