Föreläsning 1: How to get DNA

I DNA binder G till C (G-C) och A till T (A-T). Vilken av dessa par binder till varandra starkast

G-C har 3 vätebindningar

A-T har 2 vätebindningar

Därför har G-C starkare bindning och därmed är en DNA-region med mycket G-C svårare att klyva. Det kräver högre energi/temperatur att separera strängarna

Hur kan vätebindningar mellan basparen bli starkare och varför är detta viktigt?

Med hjälp av vissa metalljoner som t.ex Mg²⁺.

Detta är viktigt eftersom vissa metoder såsom PCR och hybridisering är beroende av precisa temperaturkontroller baserad på GC-innehållet

Åt vilket håll syntetiseras DNA och varför är detta viktigt?

Åt 5’ → 3’. Detta för att 3’-kolet har en en OH-grupp som deltar i reaktionen där en ny nukleotid (dNTP) binder in. OH reagerar med fosfat som sitter på 5’-kolet på den nya nukleotiden.

PCR och DNA-syntes är beroende av denna reaktion. Utan OH-gruppen hade ingen syntes skett.

Vad är en vektor

En DNA-molekyl som används för att transportera en specifik DNA-fragment. Kan replikeras inom en cell till flera kopior.

Oftast används plasmider eller bakteriofager (virus) som vektor

Vad är en plasmid

• Små cirkulära DNA-molekyler som finns naturligt i bakterier. De är inte en del av själva kromosomen och kan replikeras av sig självt.

• Plasmider används i gentekniken för att:

  • De är små och enklar att arbeta med

  • De kan bära på annan DNA

  • De kan kopieras av bakteriella enzymer

• Det finns olika typer av plasmider

• En begränsning som plasmider har är att de inte kan bära på stora DNA-fragmenter (bara några tusen baspar)

Beskriv Resistance plasmid

bär på gen till antibiotikaresistans (används för att selektion)

Beskriv Col plasmid

producerar proteiner (colicins) som dödar andra bakterier

Beskriv Degradative plasmids

hjälper bakterierna att bryta ner ovanliga substanser

Beskriv Virulence plasmid

bär på gener som gör bakterier farligare

Beskriv Cloning vectors

används i gentekniken för att införa nytt DNA

Beskriv Yeast plasmid

används i eukaryota celler såsom jäst

Vad är bakteriofager

• Virus som kan infektera bakterier

• Naturliga vektorer eftersom de kan injicera DNA in i bekteriecellerna

• Kan bära på större DNA-fragmenter än plasmider (40 000 - 50 000 baspar)

• Två sorters:

  • Head-and-tail fager: kan injicera DNA til bekterier genom sin svans

  • Filamentous fager: enkla och trådliknande. Binder till cellytan och injicerar DNA genom pilus

Om man ska använda virus som vektor, var på dess DNA ska man integrera genen/DNA-fragmentet

I b2-regionen för att det är den regionen på dess DNA som inte är essentiell för kloning. Resten är regioner som innehåller sekvens för proteiner som är nödvändiga för infektion

Vad är rekombinant DNA

En DNA-molekyl som består av DNA från olika källor

Vad är en klon

En klon är en grupp av genetisk identiska celler eller organismer

Varför vill man klona DNA

För att kunna isolera en specifik DNA-fragment som ska studeras

Hur klonas en gen

1. Blanda DNA-fragmenter med vektorer (som plasmider) → bildar rekombinant DNA

2. Varje plasmid innehåller en specifik DNA-fragment → kan spåra tillbaka och studera en gen per koloni

3. Transformera bakteria med plasmid → kopierar plasmiden

4. Odla cellerna på en platta

5. Varje koloni på plattan är en klon → miljontals kopior av en gen på ett ställe

Hur extraheras en gen från en kromosom

Två metoder:

1. DNA klyvs i sina gener och de introduceras till vektorer → separerar sedan vektorn med målgenen från resten

2. Om man vet gensekvensen så kan man använda primers → då kan man replikera målgenen direkt mha PCR och tillsätta de i en vektor

Beskriv de generella stegen för DNA-upprening från bakterieceller

1. Odling av bakteriekultur där cellerna sedan separeras (centrifugering)

2. Cellerna bryts som ger en cellösning (cell extract)

3. DNA renas upp från cellösningen

4. DNA koncentreras

Hur gör man en cellösning (cell extract)

1. Cellväggen och cellmembranet ska brytas ned → cellösning

2. Sedan centrifugeras cellösningen för att få endast DNA, RNA och proteiner

Hur får man ut DNA från cellösningen

Två vägar:

A) De kontaminerande ämnena bryts ned

B) DNA separeras från de kontaminerande ämnena

Beskriv användningen av fenol-kloroform för nedbrytning av kontaminerande ämnen när DNA ska isoleras från cellösningen

• De denaturerar proteiner i cellösningen

• Delar upp cellösningen i lager:

  • Översta lagret med DNA/RNA

  • Ett lager med denaturerade proteiner

  • Längst ner fenol

• Fenol är dock väldigt giftigt

DNA precipitation: Hur isolerar man DNA från kontaminerande ämnen i en cellösning mha etanol?

• Tillsats av salter som neutraliserar DNA:s negativa laddning och möjliggör utfällning

• När etanol tillsätts i cellösningen minskar DNA:s löslighet i vatten genom att den stör vattenstrukturen runt DNA

• Vid centrifugering fälls DNA sedan ut och hamnar i pelleten

• Eller så kan en glasstav användas för att dra upp DNA-molekylen (synlig)

Hur fungerar DNA-isolering mha guanidinium thiocyanate

1. Add guanidinium thiocyanate (a chaotropic salt) → helps DNA bind to silica.

2. Run solution through a silica column:

   • DNA sticks, other stuff washes away.

3. Final wash with water or buffer releases pure DNA.

Hur sker plasmid-isolering genom storlek

• Höga pH-värden denaturerar de större DNA-strängarna från kromosomen men plasmiden som blir tvistad kan klara sig

• Vid centrifugering separeras sedan plasmider från resterande DNA supernatanten innehåller plasmider.

Hur kvantifieras DNA

Genom spektrofotometer:

• mäter absorbansen vid 260 nm (våglängden där DNA absorberar maximal uv-ljus)

• Inte precist

Vad är polymerase chain reaction (PCR)

Det är en metod för att syntetiseras en specifik DNA-sekvens flera gånger mha specifika primers som hittar sekvensen. Endast den delen av intresse kommer att amplifieras

Vad behövs det för att kopiera en DNA-sekvens i tub?

• Mall (template): DNA-sekvensen som ska kopieras

• Polymeras: den ska vara termostabil; t.ex Taq

• Nukleotider: dATP, dCTP, dGTP, dTTP (basparer)

• Primers: vägleder polymeras på vart den ska syntetisera

• Rätt miljö: temperatur, pH (buffer) och saltkoncentration (enzymaktivitet)

Primers är en viktig komponent i PCR. Beskriv de.

• De definierar sekvensen som ska kopieras till polymeras

• Primers konstrueras efter den specifika DNA-sekvensen som man vill kopiera

• Primers konstrueras även efter hur man vill använda sekvensen sen

Beskriv “thermocycling” (temperaturjustering) under PCR

1. Denaturation: Temp. höjs till ungefär 95°C för att bryta vätebindningarna mellan dsDNA så att DNA-molekylen blir till ssDNA

2. Annealing: Temp. sänks till under smältpunkten av primersen (ca 45-60°C) så att primer kan binda in till ssDNA

3. Extension: Temp. höjs till DNA-polymerasets optimala aktivitet vilket är lite över 70°C s → poleras kopierar från mallen

Genom att justera temperaturen på detta sätt kan dessa tre processer sättas igång automatiskt i tuben.

Under PCR produceras inte målsekvensen förrän de tre första cyklarna. Beskriv de tre första cyklarna.

1. Efter denaturering av dsDNA binder primersen in på 3’-änden av DNA-mallen för att DNA-polymeras syntetiserar 5’→3’. Produkten av första cykeln kommer inte vara den specifika sekvensen för att DNA-polymeras kommer att kopiera resten av DNA-mallen

2. Vid andra cykeln binder primern igen vid 3’-änden fast på produkten från 1:a cykeln. Polymeras börjar då att syntetisera tills strängmallen tar slut vilket är vid dess 5’. Produkten blir då målsekvensen

3. Vid denna cykeln börjar syntesen av målsekvensen.

Recept för PCR standard reaction mix 5-100 ul

• Templat: DNA/RNA

• Primers 0,1 - 10 uM

• dNTPs: 0,2 mM

• Termostabil DNA-polymeras: 0,1-5 U

• Buffer + joner: KCl, MgCl2 och TRIS

• Vatten

Vad ska man tänka på när man konstruerar primers?

• Att båda primersen (en för varje ssDNA 5’→3’ och 3’→5’) ska vara i motsatt riktning

• Båda primersen ska ha ungefär lika smältningpunkter annars kan den ena binda in senare än den andra → ineffektiv

• De måste vara tillräckligt långa för att öka specificiteten för DNA-sekvensen

• Men de ska inte heller vara för långa för att annars tar deras inbindning för lång tid

• Undvik komplementaritet både inom och mellan primersen. Komplementaritet mellan primersen leder till att de binder till varandra istället för DNA-strängen. Komplementaritet inom primern leder till att de bildar hårnålar vilket hindrar de från att binda till DNA

Vad har primers smältpunkt för påverkan på dess inbindning till DNA-strängen

• Temp mycket lägre än Tm: primers kan binda ospecifikt

• Temp för högt: primer binder aldrig → ingen PCR

Den optimala temperaturen för inbindning har empiriskt bestämts till 1-2 °C lägre än Tm

Hur påverkar primers längd PCR

Längden = specificiteten

Ju längre desto mer specifikt

PCR primers for gene cloning

In cloning, the goal is not just to amplify DNA — you also want to insert it into a plasmid. To do this smoothly, primers can be designed to include extra sequences at their 5′ ends.

What’s added to the primers:

1. Restriction sites:

   • These are specific DNA sequences that can be recognized and cut by restriction enzymes (e.g. BamHI).

   • By adding a restriction site to the primer, you ensure the PCR product can be cut and ligated into a plasmid that has matching sites.

2. Extra bases (like ‘A’ overhangs):

   • Some DNA polymerases (like Taq) naturally leave an extra adenine (A) at the 3′ ends of PCR products.

   • These A-overhangs match up with T-overhangs on special vectors called T-vectors → makes cloning easier without restriction enzymes.

Vad är degenerate primer

Ett sätt att hitta DNA-sekvensen för ett känt protein

1. Use the genetic code to reverse translate the protein into all possible DNA sequences.

   • Each amino acid can be coded by multiple codons (e.g. Leucine = TTA, TTG, CTT, etc.)

   • This creates multiple possible DNA sequences for the same protein

2. Make a degenerate primer:

   • A primer that includes all those possible combinations at each base position.

   • Often written using special codes (e.g. N = any base, R = purine)

3. Use the degenerate primer in PCR to screen a library of DNA fragments:

   • Pair it with another degenerate primer or a known vector primer (if the DNA is cloned in a plasmid)

   • Helps identify the DNA that codes for the protein of interest

Summary:

• You have the protein sequence but not the DNA.

• The genetic code is redundant = överflödig, so each amino acid can be coded for by many DNA codons.

• A degenerate primer includes all possible DNA combinations for a given protein.

• You use that primer in PCR to try to find the gene.

It’s a way to discover genes even without knowing their DNA code.

Hur påverkar valet av olika polymeraser för PCR

• Taq: snabb, enkel och billig. Används vid vanlig PCR där små fel inte spelar så stor roll

• Pfu, Phusion: har hög säkerhet (har “proof-reading”). Används för kloning, sekvensering och mutationsdetektion

Hur tolkar man PCR-resultat

Utför gelelektrofores:

• DNA-fragmenten separeras baserad på storlek genom att använda en spänning över en agrosgel

• Banden representerar DNA-fragment som har amplifierats. Ju starkare band desto mer DNA.

• En ladder används för att jämföra fragmentstorleken

Om:

• Ett band av tänkt DNA-storlek = lyckad PCR

• Flera band = icke-specifik amplifiering (primersen behöver omdesignas)

• Inga band = PCR misslyckad (kontrollera reagenterna, primer bindning, templatkvalite)

Strategier för olika PCR-resultat

• Band in negative control: Contamination → use fresh reagents.

• Multiple bands: Primers are not specific → redesign primers.

• Band only in negative control: Contamination, again → clean your workspace.

• No bands at all:

  • Primer not binding? → check sequence.

  • Target DNA fragment not present? → try another sample.

  • DNA degraded? → isolate again.

• Band only in positive control: Target DNA may be missing in your samples.

• Adjust conditions:

  • Increase annealing temp if nonspecific binding.

  • Lower annealing temp if primers not binding.

  • Modify Mg²⁺ concentration (important cofactor).

Vad är reverse transcription PCR

Används om startmaterialet är RNA:

• DNA är mer stabil än RNA → RNA konverteras till DNA (cDNA)

• Tillåter att:

  • studera gener (mRNA → cDNA → PCR)

  • ta bort introner från eukaryota gener innan kloning

  • detektera RNA virus såsom SARS-CoV-2

Vad är quantitative PCR (qPCR)

Purpose: Measure how much DNA is present, in real time.

How it works:

• Uses fluorescent dyes (e.g. SYBR Green) that bind double-stranded DNA.

• As DNA is amplified, fluorescence increases.

• A threshold level = (tröskelnivå) is set = number of cycles to reach this tells how much DNA was present initially. den punkt där signalen blir tillräckligt stark för att särskiljas från bakgrundsbrus.

Graph:

• X-axis: Cycle number

• Y-axis: Fluorescence = DNA amount

• Earlier curve crosses threshold → higher starting DNA amount

Varför används qPCR

• Kvantitativt: mäter mängden DNA och inte bara att det finns

• Känslig: känner små DNA-mängder tidigare

• Specifik

• Ingen agarosgel behövs

• Inte begränsad av reagenser

Vad är probe-basied qPCR

This is a more specific version of real-time PCR (qPCR) that uses a labeled DNA probe to detect amplification only when the correct DNA sequence is present.

How it works:

1. A probe is designed to match the target DNA sequence.

2. The probe contains:

   • A fluorescent reporter at one end.

   • A quencher at the other end (prevents fluorescence when the probe is whole and not cleaved by DNA polymerase).

3. During PCR:

   • The probe hybridizes to the target DNA (binds between primers).

   • As DNA polymerase extends the primer, it meets the probe and cleaves it.

   • The reporter is separated from the quencher.

   • This releases a fluorescent signal, which is detected.
     

Advantages over SYBR Green-based qPCR:

• High specificity: Fluorescence only occurs if the probe binds to the correct DNA.

• Reduces false positives:

  • SYBR Green binds to any double-stranded DNA, including nonspecific products and primer-dimers → can give misleading results.

  • Probe-based qPCR avoids this problem.
    

Key Note:

• The probe is not destroyed during the reaction, allowing precise signal monitoring.

• Electron transfer between quencher and fluorophore controls the fluorescence.

  • When cleaved: light (hv) is emitted = signal increase.

Användning av qPCR - matsäkerhet

qPCR används mycket för att hitta farliga bakterier i mat:

• Snabb och specifik

• Listeria, E. coli, Salmonella, restbakterier i öl

• Kan hitta väldigt få bakterier: 1-10 celler per 25 gram

• Används för prova GMO livsmedel