Kaarten: Moleculaire biologie H6: Wat gebeurt er met een eiwit na de translatie | Quizlet

Welke cellulaire mechanismen beïnvloeden de eiwitstructuur?

- de aminozuur-sequentie

- de moleculaire chaperones HSP60 en HSP70

- posttranslationele modificaties

- proteasen

De moleculaire chaperons HSP70 en HSP60

gespecialiseerde enzymen die eiwitten (200 - 300 mg/ml) helpen om zo snel mogelijk de juiste vorm aan te nemen, zodat ze niet precipiteren in de cel

Chaperone-eiwitten of hsp70

= heat shock protein met moleculaire massa van 70 kDa

Functie?

- herkent sequentie van zevental hydrofobe AZ in een eiwitsequentie die uit het ribosoom komt

- ATP-gebonden: stelt hydrofobe bindingsplaats op voor interactie met hydrofobe eiwitdelen

- ADP-gebonden: gesloten conformatie waarin het eiwitdeel de juiste conformatie kan aannemen

Chaperonine of hsp60

= heat shock protein met moleculaire massa van 60kDa

Functie? kamertje vormen bestaande uit twee ringen met elk 7 hsp60 moleculen

Werking:

- hsp60 vormt kamertje

- ATP-gebonden dekseleiwit bedekt het kamertje

- eiwit 15 s in moleculaire kamertje

- conformatie-verandering kamertje

- ATP naar ADP > dekseltje komt los

- eiwit uit kamertje (ook als slecht geplooid)

Meest voorkomende posttranslationele modificaties

- fosforylaties (Ser, Thr, Tyr)

- vorming van disulfidebruggen (tussen twee Cys)

- proteolyse (zie ook afbraak van eiwitten)

- glycosylering (van Asn, Ser en Thr): afzetting van specifieke suikergroepen

- binding van cofactoren en metalen (bv. GTP aan EF-Tu, Zn aan Cys of His, zie DNA-bindende eiwitten H9)

- acetylering (van Lys) en methylering (van Lys en Arg)

-> zie ook transcriptieregeling bij eukaryoten H9

- ubiquitinering (zie later)

Proteolyse

= het hydrolyseren van polypeptideketens door proteasen

Toepassingen/doel?

1. proteïnen die hun rol hebben gespeeld moeten selectief en gecontroleerd worden afgebroken > recyclage van AZ voor nieuwe eiwitten

2. eiwitten uit het voedsel moeten afgebroken worden tot korte polypeptideketens en aminozuren

3. activering van pro-enzymen door verwijderen van specifieke eiwitfragmenten (vorm van posttranslationele modificatie)

Vertering van eiwitten door proteasen

Functie proteasen? eiwitten splitsen door hydrolyse van de zeer stabiele peptidebinding

1. Maag

- denaturatie van de eiwitten door het zure milieu

- peptidebindingen bereikbaar gemaakt voor proteasen...

Niet-specifieke proteasen:

- onafhankelijk van de aminozuursequentie van het substraat

- kan alle eiwitten afbreken

- vb. pepsine: actief in de maag bij zeer lage pH (2, maagzuur)

Substraat-specifieke proteasen: hydrolyseren enkel peptidebindingen in de buurt van specifieke sequenties

2. Dunne darm:

- proteasen afgescheiden door de pancreas breken eiwitten af tot di- en tri-peptiden en vrije aminozuren

- het darmepitheel neemt ze op

- de di- en tri-peptiden worden in het membraan van deze cellen en intracellulair verder afgebroken tot vrije aminozuren

3. De bekomen vrije aminozuren worden over het hele lichaam verspreid via de bloedbaan

Chymotrypsine

= protease dat extracellulair in het verteringsstelsel actief is

Enzymatische werking in twee stappen:

1. acylatie: covalente modificatie van het enzym

- nucleofiele aanval op de carbonylgroep van het substraat via een specifiek en zeer reactief Serine

- nucleofiel Serine in het chymotrypsine voor zeer korte tijd covalent verbonden met substraat

- carboxy-terminaal gedeelte van het eiwit afgesplitst

2. deacylatie: enzym komt terug vrij van het substraat

3D-structuur:

- catalytische triade in het actief centrum bestaat uit drie residu's: Aspartaat, Histidine en Serine

- Asp oriënteert His > goede acceptor voor het proton van de serine zijketen > zeer reactieve Ser > aanval peptideketen

Substraat-specificiteit:

- chymotrypsine knipt aan de carboxy-terminale zijde van grote hydrofobe aminozuren (Trp, Tyr, Phe en Met)

- 3D-structuur: S1 hydrofobe pocket in het AC waarin de grote ongeladen zijketens van Phe en Trp passen

>< trypsine heeft een negatief geladen S1-pocket voor Arg

Pockets

= 'pockets' aan de oppervlakte van het enzym, waar specifieke zijketens van substraten inpassen

Nomenclatuur:

- S: aminoterminaal van de knipplaats

- S': carboxy-terminale kant

- P: bindingsplaatsen voor proteasen

- nummer = afstand tov de peptidebinding die gehydrolyseerd zal worden

Classificatie van de proteasen

1. Serine proteasen

- voorbeeld: chymotrypsine

- reactief residu: Serine

- uitgebreide groep

2. Cysteine proteasen

3. Aspartyl proteasen

4. Metallo proteasen

-> bij al deze enyzmen wordt een nucleofiel aanval uitgevoerd op de carbonylgroep in de peptidebinding

Activering van enzymen door proteolyse: zymogenen

- enzymen worden gesynthetiseerd als inactieve precursoren

- doel: gecontroleerde activatie van enzymen na translatie

- activatie door specifieke proteolyse

- geen ATP nodig voor activatie

- belangrijk voor de activatie van extracellulaire enzymen (extracellulair geen ATP beschikbaar)

- voorbeelden: enzymen bij vertering (chymotrypsinogeen en pepsinogeen), bloedstolling, geprogrammeerde celdood, ...

Zymogeen chymotrypsinogeen

- precursor/pro-enzym/zymogeen van chymotrypsine

- 245 AZ lang

Actieve vorm = α-chymotrypsine

-> A, B en C ketens verbonden met disulfidebruggen

Activatie: trypsine (Serine-protease) en chymotrypsine behandeling

1. peptideketen verbreken tussen positie 15 en 16

2. conformatieverandering geïnduceerd

3. ontstaan substraat-bindingsplaats en catalytisch centrum

Zymogeen trypsinogeen

Actieve vorm = Trypsine

- activeert zymogenen die gesynthetiseerd worden in de pancreas en in het duodenum terechtkomen voor vertering

- activeert ook zelf trypsinogeen

Activatie door...

- enteropeptidase dat afgescheiden wordt van de wand van het duodenum

- trypsine

Effect:

- proteasen worden zeer snel geactiveerd wanneer hun substraten (gedenatureerde eiwitten in de darm) aanwezig zijn

- controle van processen via cascades (vb. bloedklontering)

Protease-inhibitoren als geneesmiddelen

Doel protease-inhibitoren:

- sterke controle van de activiteit van proteasen zodat eiwitten niet worden aangevallen

- aanval op eiwitten door proteasen die vrijgekomen zijn bij zuivering (openbreken van de cellen) vermijden

Medische toepassingen:

1. Trasylol

- bevat de protease-inhibitor aprotinin

- inhibeert Serine proteasen betrokken bij cascades voor bloedklontering

- labo: zuivering van eiwitten

- vroeger gebruikt bij traumatische of hemorragische schok omdat het de afbraak van bloedklonters door lichaamseigen proteasen kan inhiberen > te ernstige bijwerkingen

2. behandeling van HIV: proteasen remmen die nodig zijn voor de synthese van nieuwe viruspartikels

Intracellulaire afbraak van eiwitten

Wat bepaalt de concentratie van een eiwit in een cel?

- de snelheid van de synthese

- de snelheid van de afbraak

- zeer effectieve regeling door eiwitten sneller aan te maken en af te breken

- verwijdering van 'foutief geplooide' en 'versleten' eiwitten

Te hoge concentratie in het cytoplasma > precipitatie

Het proteasoom

Wat is een proteasoom?

- ATP-afhankelijk proteolytisch complex

- 1% van de totale eiwitten in een cel

- sedimentatiecoëfficitent 26S

- 19S: deksel-gedeelte

- 20S: cilinder dat de catalytische activiteit uitvoert

-> bevat de proteasen

-> actieve centra gericht naar het lumen van de cilinder

-> afscherming van eiwitten in het cytoplasma

Functie? gecontroleerde intracellulaire afbraak van eiwitten

Merking van af te breken eiwitten via ubiquitine:

- klein eiwit (8,5 kDa)

- ± 80 AZ

- (ubiquitous = overal voorkomend)

Afzetting van ubiquitine door 3 specifieke enzymen:

- Ubiquitine-activerend enzym (E1): één soort

- Ubiquitine-conjugerend enzym (E2): 30-tal (één familie)

- Ubiquitine-proteïne-ligae (E3): 100-tal (meerdere families)

Werking van het proteasoom

1. Ubiquitine-activerend enzym (E1)

- activatie van ubiquitine via adenylatie

- vorming thioester-binding tussen het carboxyterminaal uiteinde van ubiquitine en een sulfhydrylgroep van een Cys in het E1 enzyme

2. Ubiquitine-conjugerend enzym (E2) neemt de ubiquitine over op een Cys (transfer)

3. Ubiquitine-proteïne-ligae (E3): transfer van ubiquitine naar een ε-aminogroep van een lysine van het doelwit door de vorming van een isopeptidebinding

4. Vorming van poly-ubiquitines

- Ub bevat zekf ook Lys acceptor-sites voor Ub > ketens

- proteasoom herkent ketens van minstens 4 ubiquitines

5. Herkenning door het proteasoom

- subunits van het deksel herkennen de poly-ubiquitines

- afsplitsing door isopeptidase activiteit

- recyclage van Ub

6. Werking proteasoom

- een specifieke klasse van ATPasen denatureert het eiwit

- vervoer naar het interieur van het 20S onderdeel

- proteasen breken de eiwitten af tot korte peptideketens

7. In het cytoplasma

- peptideketens worden afgebroken tot aminozuren

- recyclage van AZ

Controle van proteolyse = cruciaal voor het functioneren en overleven van een cel

Het proteasoom controleert proteolyse in tal van cellulaire processen...

Voorbeeld 1: afbraak van cyclines

- concentratie van cyclines is afhankelijk van de celcyclusfase

- bij initiatie van DNA-replicatie (begin van S-fase) wordt cdc6 gefosforyleerd

- gefosforyleerd cdc6 wordt herkend door E2 en E3 en snel afgebroken door het proteasoom

Voorbeeld 2: HPV-infectie en p53-degradatie

Papilliomavirus (HPV)

- kan baarmoederhalskanker veroorzaken

- heeft een gen dat codeert voor een eiwit dat de afbraak van het p53 eiwit stimuleert

Tumorsuppressor p53

- voorkomt kanker

- geeft apoptose signaal waneer er teveel DNA schade is

HPV-infectie

- p53 wordt afgebroken

- gevolg: verhoogd aantal mutaties > kanker

- gelinkt met 90% van de baarmoederhalskanker gevallen

Hoe kan een HPV infectie baarmoederhalskanker veroorzaken?

DNA schade activeert het p53 eiwit en leidt tot...

- stilvallen van de celcyclus

- apoptose van de normale cellen

HPV-infectie:

1. expressie van het E6 eiwit vanuit het virale genoom

2. vorming E6-E6AP complex

= ubiquitine ligase (E3-ligase) dat p53 polyubiquitineert

3. het proteasoom breekt p53 af

Gevolg:

- cellen gaan niet meer in apoptose bij DNA schade

- kan aanleiding geven tot mutaties en kanker

E6 (early gene nr 6)

- eiwit van het virus

- E2 ubiquitine-conjugerend enzyme

E6AP (E6 associated protein)

- eiwit in normale lichaamscellen

- vormt een E3 ubiquitine ligase met E6

Functies van poly- en mono-ubiquitines

Functies van polyUb:

1. degradatiesignaal voor proteine-afbraak

2. groeit op Lysine 48 en wordt herkend door het proteasoom

3. stabilisatie van eiwitten

4. herkenning door andere eiwitten

Functie van monoUb: monoubuitinatie van histonen op hun histonstaart > herkenning door chromatineremoddeling complexen