Immunofluorescence des protéines impliquées dans le cycle cellulaire BCMII

Immunofluorescence BCM II

Quelles sont les différentes phases du cycle cellulaire?

G1 : la cellule grossit et fabrique de nouvelles protéines

Transition G1/S : point de restriction (checkpoint)

S : duplication de l’ADN (réplication)

G2 : synthèse de protéines nécessaires à la mitose

M : mitose + cytodiérèse

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La plupart des cellules souches d’un organisme adulte se trouvent en phase G0.

Où agissent les checkpoint du cycle cellulaire ?

Checkpoint G1 : - taille adéquate de la cellule ? nutriments et facteurs de croissance disponibles ? ADN endommagé ?

Checkpoint S: Réplication de l’ADN complète et sans erreurs ?

Checkpoint de G2 : taille adéquate de la cellule ? Réplication de l’ADN complète et sans erreurs ?

Checkpoint mitotique : Tous les chromosomes sont bien attachés aux microtubules du fuseau mitotique ?

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Par quoi est régulée la progression des cellules dans le cycle cellulaire ?

Elle est régulée par :

* des facteurs intracellulaires : cyclines et des kinases dépendantes de cyclines
* des facteurs extracellulaires: facteurs de croissance, hormones..

Quelles sont les caractéristiques associées aux cyclines ?

Ces dernières agissent en tant que facteurs intracellulaires dans la progression du cycle cellulaire.

* Leur concentration est variable au cours du cycle cellulaire.
* Elles sont synthétisées et dégradées de façon cyclique
* Elles se lient aux kinases dépendantes de cycline.

Quelles sont les caractéristiques associées aux kinases dépendantes de cycline ?

Elles agissent en tant que facteurs intracellulaires dans la progression du cycle cellulaire.

* leur concentration est constante au cours du cycle cellulaire.
* Elles sont stables dans la cellule
* Elles sont activées par liaison aux cyclines
* Elles phosphorylent, activant ou inactivant des protéines spécifiques.

Quels sont les complexes Cyclines / kinases dépendantes de cyclines spécifiques à chaque phase du cycle ?

Cycline de la phase G1: cycline D et E

Kinases dépendantes de cyclines de la phase G1: CDK 4, 6 et 2

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Cycline de la phase S: cycline A

Kinases dépendantes de cyclines de la phase S: CDK 2

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Cycline de la phase M: cyclines A et B

Kinases dépendantes de cyclines de la phase M: CDK 1

Donnez un exemple de complexe Cycline/ kinase dépendante de cycline régulant l’entrée en mitose.

MPF (mitose promoting factor), permettant en autre la phosphorylation de la lamina nucléaire et donc sa dissociation.

Par quoi est régulée l’activité des kinases cyclines dépendantes ?

Concentration en cycline

Quel est le principe de l’immunofluorescence ?

Les anticorps se lient spécifiquement à un antigène.

Les anticorps couplés à un fluorochrome permettent d’observer la localisation des protéines en microscopie à fluorescence.

La fluorescéine et la rhodamine sont les fluorochromes les plus utilisés.

Quel est le principe d’une immunofluorescence par technique directe ? Quels sont les avantages et les inconvénients associés à un marquage direct ?

La protéine cible est détectée par un anticorps primaire couplé à un fluorochrome.

A: peu d’étapes

I: peu sensible

En quoi consiste un marquage indirect par immunofluorescence ?

La protéine cible est détectée par un anticorps primaire. Cet anticorps primaire sera reconnu par des anticorps secondaires couplés à des fluorochromes.

A : amplification considérable possible

I : plusieurs étapes

Quels sont les 2 spectres associés à l’immunofluorescence ?

spectre d’absorption (de la lumière incidente) et le spectre d’émission de fluorescence.

Quelles sont les origines possibles de la fluorescence observée?

* fluorescence naturelle d’une substance située dans la cellule (chlorophylle)
* Substance fluorescente se fixant spécifiquement sur une structure (DAPI qui se fixe sur l’ADN et colore en bleu)
* substance non spécifique fluorescente naturelle qui peut être couplée à un anticorps spécifique d’un antigène. (Rhodamine et fluorescéine)

Qu’est ce que le bruit de fond ?

fixation non spécifique de l’anticorps secondaire.

Quelle est la solution utilisée lors d’une immunofluorescence ?

pré-incubation avec sérum isotopique à l’anticorps secondaire.

Quelle substance permet la fixation du contenu cellulaire ?

méthanol

Qu’est ce que le PBS ?

solution tampon ==> lavage des cellules pour éliminer l’excès de la dernière solution utilisée.

Que permet le triton ?

Perméabilisation de la membrane cellulaire.

Par quoi peut être marqué l’ADN ?

Iodure de propidium et DAPI