Bioteknik kursprov

Homolog rekombination

Liknande gener sammanfoas

Transposon

hoppande gener

Upptäcktes av Barbara McClinton

Transformation

Tar upp DNA frå omgivningen

Konjugation

plasmid överförs vis f-pili

Transduktion

Bakteriofag överför gener till en annan bakterie

Probiotika

Ilja Metjinikov (rysk immunolog) fick nobel priset i medicin eller fysiologi 1908. Han märkte att människo som åt yoghurt regelbundet var friskare än andra. Han antog att bakterierna som fanns i yoghurten hade hälsofrämjande bakterier.

Probiotika finns i jästa produkter och mjölkprodukter ( det är svårt att säga om den positiva effekten av laktobaciller är pga probiotikan).

Vissa bakterie stammar kan eventuellt bidra till att sänka kolesterolhalten i blodet. Probiotika kan även ha positiv effekt på immunförsvaret.

Normalflora

Människan lever i symbios med microorgansimer, de är en del av vår normalflora. Bakterier finns tex på våran hud och i våra tarmar. De är en viktig del av vårat immunförsvar, tarmfloran (ca 400 olika bakteriearter) sår för en stor del av ämmesomsättning. Ex: bryter tarmfloran i tjocktarmen ned kostfibrer ocg andra. ämnen som människo kroppen inte själv kan spjälka.

Totalt finns det 10 gånger så många bakterier som kroppsceller i en människa

Morfologiska grupperna

Koker, stavar, spriller och spiroketer, (avvikande: vibron, filamentösa bakterier)

indelning som bygger på utseende hos bakterier (finns också hos arkeer)

Koker

Runda

Stavar (baciller)

avlånga och cylindriska

Spirill

Spiralformade och rör sig m.h.a flagell

Spiroket

Mer vridna än spiriller och rör sig med roterande cell rörelser

Ribosomen

Byggs upp av RNA och proteiner. Består av 2 subenheter (lilla och stora). De är olika stora hos olika bakterier respektive eukaryoter.

Vad består bakterier generellt av?

• Nukleinsyrorna DNA & RNA

• Cellmembran

• Cytoplasma

• Ribosomer

Vilka övriga strukturer kan finnas i bakterier?

• Plasmider

• Flagell

• Cellvägg

• kapsel

• pili

• Inklusionskroppar

• Endosporer

S= Svedbergenhet

Sedimentationskoefficient som är ett mått på den hastighet med vilken en macromolekyl/ partikel sedimenterar.

Plasmider

En ringformad DNA molekyl som är mycket mindre än kromosomen. Innehåller enstaka gener. Plasmider replikeras autonomt och inte enbart vid celldelning. I gentekniken kan plasmider utnyttjas för att infoga gener in i en bakterie. Gener som kodar för antibiotikaresistens sitter ofta i plasmider. Plasmider kan föras över med så kallade f-pili.

Inkusionskroppar

Där olika ämnen (lipider, polysakarider m.m) kan ligga lagrade i cellplasma som omringas av ett komplex av polymerer

Cellmembran

dubbelt lagar av fosfolipider där de hydrofila delarna är vända mot ut sidan och hydrofoba delarna mot varandra.

Cellvägg

Cellväggen kan saknas hos vissa bakterier. Tex mycoplasma.

Vad är cellväggens funktion?

• Skyddar cellen från att sprängas av det höga vätsketrycket inuti cellen.

• Skyddar mot toxiska ämnen

• möjliggör olika former

Vad är cellväggen uppbyggt av?

Peptidogykan

Peptidoglykan

En polysakarid som är uppbyggt av N-acetylglukosamin & N-acetylmuraminsyra.

Grampositiva bakterier

• Tjockt lager peptidoglykan (upp till 40)

• Ibland finns teikonsyra insprängt i cellväggen. - bidrar till negativ yta vilket underlättar inbinding till olika ytor och därmed infektion av människor.

• ibland finns lipoteikonsyra, en teikonsyra som binder till en lipid i cellmembranet.

Gramnegativa bakterier

• Mycket tunns lager peptidoglykan (iland endast 1)

• Yttre membran, byggs upp av

  • dubbelt lager fosfolipider,

  • lipoproteiner (fäster yttre membranet i cellväggen)

  • Poriner (proteiner som släpper igenom ämnen, kan vara specifika/ ospecifika.

  • LPS komplexet (lipopylosakarider)

LPS komplexet

Innehåller en lipid del lipid A, som stiker ned i det yttre membranets fosfolipid lager. Till lipid A binder en polysakaridkedja där den ena delen är konstant och den andra delen varierar mellan arter (o-antigen)

Periplasmatiska utrymmet

En gele likande vätska som innehåller en hög halt proteiner. Vissa proteiner fungerar som hydrolitiska enzymer och bryter ner stora molekyler till mindre delar. Andra proteiner binder till ämnen som ska transporteras in i cellen.

Kapsel

Vissa bakterier har en kapsel utanför cellväggen. Uppbyggt av polysakarider, iland polypeptider eller båda. Ger en kladdig yta som skyddar mot uttorkning och till viss del från immunförsvaret hos nen värdorganism. Gör så att bakterier kan kladda fast i varandra och bilda biofilmer på ytor.

Pili (fimbrier)

Korta utskott från cellen, uppbyggt av proteiner. Har 2 funktioner:

• F-pili: används för överföring av genetiskt material

• P-pili: fäster bakterien till en yta. de flesta p pili är nicshade till en specifik kolhydrat på den cell den ska fästa sig på.

Flageller

Varierar i antal beroende på släktena. Byggs upp av proteiner och består av:

• basal kropp

• krok

• filament

Används för att cellen ska kunna röra sig.

Endosporer

En del G+ kan bilda endosporer vid stress från omgivningen. Det är ett dval-liknande tillstånd där varken reproduktion eller metabolism äger rum. Innehåller ändast 15% vatten tillskillnad från vegitativt stadie då halten vatten är 70%. Endosporer är mer motståndskraftiga mot värme och uv och kan ligga vilande i över 100 år.

Negativ färgning

Bakrunden färgas, inte cellerna. Ingen fixering sker vilket förhindrar att färgämnet penetrerar cellmembrandet. Efter luft torkning ses ofärgade celler mot mörk bakgrund.

Direkt färgning

Cellerna färgas in med ett basiskt färgämne, efter någon minut kan bakterierna studeras.

Gramfärgning

• Hans Christian Gram (dansk bakteriolog 1853 -1938)

• uppfann metoden 1884 och utvecklade den för att kunna påvisa förekomst av bakterier i djurvärlden.

• Först tillsätts ett baskiskt färgämne, kristallviolett

• Sedan en jod-jod-kaliumlösning, lugols lösning. (uppfanns 1835 av franske läkaren Jean Lugol 1786-1851). Kristallviolett och lugols lösning bildar ett stort violett komplex.

• Bakterierna (G+) måste vara unga då förmågan att bilda färgkomplexet förloras med åldern

  • Vid tvätt av etanol löses lipider upp —> G- bakteriers yttre membran förstörs och färgkomplexet extraheras.

  • G+ bakteriers cellvägg dehydreras —> minsakr porstorlek —> mer kompakt cellvägg —> extraktion av färgämnen motverkas

  • De G- bakteirerna färgas sedan in med ett annat färgämne, safranin röd

maximum temperatur

begränsar tillväxt

Optimium temperatur

ger maximal tillväxt

Maximumtemperatur

begränsar tillväxt

Lagfas

Vid ympning (överföring av bakterier till ett medium) tar det en stund innan deling börjar

Accelerationsfas

ökande antal celler

logfas

Cellerna delar sig med konstant hastighet dp förhållandena är optimala. Den maximala tillväxthastigheten nås här.

Retardationsfas

Näringsbrist börjar påverka celldelning så den börjar avta. Ansamling av toxiska avfallsprodukter kan påverka

Stationärfas

Maximala antalet celler är nått balance mellan tillväxt och avdelning.

Deklinationsfas

Fler bakterier dör än som bildas. Antalet levande celler i lösningen minskar

Zebra fisk

Danio rerio. Fosterutveckling och hur den påverkas av miljögifter och läkemedel.

Husmus

Mus musculus. Däggdjurs funktion (därmed människor).

Louis pasteur

Rabiesvaccin, pastörisering, sterilisering inom kirurgin, jäsning & förmultningsprecesser.

Han studerade flera olika svanshals-flaskor med samma lösningar. Båda började sterila varpå den ena lämnades som den vara och den andre slogs halsen av på. Han visade att bakterierna inte tog sig igenom den smala halsen utan höll sig ute. Flaskorna ned avslagna halsar förblev inte sterila utan bakterie tog sig in igen.

Joseph Lister

Antiseptiska metoder för sårbehandling

Använde pasteurs teorier om mikroorganismens roll vid smittoöverföring genom att införa tvättning av sår med karbolsyra. Minskade dödligheten vid Glasgow royal Infirmary från 45% till 15%

Robert Hooke

Elasticitetslagen, balnd de första förespråkaren för evolutionsteorin. Mikroskopiska bikåkehåligheter i kork vilket bidra till cellbiologins historia

han utvecklande ett ljusmikroskop med tre glas linser och et t scen ljus som användes för att belysa och förstora föremål inuti. Mikroskopet kunde användas för att undersöka föremål.

Kolkälla

Autotrof: använder koldioxid

heterotrof: använder organsiska molekyler

Energikälla

Fototrof: använder ljus

kemotrom: oxiderar organiska eller oorganiska ämnen

elektronkälla

litotrof: använder reducerade oorganiska molekyler

organotrof: använder organiska molekyler

Bakterier kräver inte bara näringsämnen utan rätt…

• pH

• salthalt

• temperatur

• vattenpotential

• syretillgång

Mesofil

15-45°C

Vilka andra strukturer kan finnas i bakterier?

• Plasmider

• Cellvägg

• flageller

• kapsel

• pili

• induktionskroppar

• endosporer

Av vem och när myntades biotekniken?

1919 av Karl Ereky

Bioteknik användning i samhället

matproduktion

hälsovårdande funktioner

en funktion för hållbar utveckling.

Vad finns inuti bakteriecellen

• Nukleinsyran DNA

• Ribosom

• Plasmider

• Inklutionskroppar

Fermentering

Jäsning. Nedbrytning av organsikt ämne utan syre.

mikrobiologi

läran om det lilla livet

Aeroba

tillväxt i normalhalt syre ca 20%

mikroaerofila

Tillväxt i syrehalter lägre än 20%

Fakultativt anaerob

kan variera metabolism beroende på tillgång till syre.

Anaeroba

tillväxt i miljöer utan syre

Aerotolerant

överlever i miljöer med syre men använder ej det.

obligat anaerob

Krävs totalt syrefri miljö för tillväxt

Deoxiribosnukleinsyra

Del av DNA nukleotiden. Ringformad sockerart med 5 kol. Saknar OH grupp på kol 2 (jämfört med ribos)

pyrimider

6-kolsring. Kvävebaserena cytosin och tymin

Puriner

5 & 6 kolsring förenad. Kvävebaserna Adenin & Guanin.

3’-5’-fosfordiesterbindning

När deoxiribinukleotiderna binder in till varandra spjäklas 2 fosfatgrupper bort. Fosfatgruppen binder då in till nästa nukleotids 3:dje kol. Det boldas en 3’-5’-fosfordiesterbindning. på grund av detta har DNA strängen en 5’ ände och en 3’ ände. I 5’ änden sitter 3 fosfatgrupper ocj i 3’ änden sitter en fosfatgrupp.

Basparning i DNA

Adenin basparar med tymin, 2 vätebindningar. Cytocin basparar med Guanin, 3 vätebindningar. Det är 0.34 nm mellan basparen.

Chargaffs regel

I DNA är mängden A=T & mängden C=G. Namngett efter Chargaff som upptäckte sambandet (1950).

Vem upptäckte DNA molekylens uppbyggnad

1953 publicerade Watson & Crick DNA molekylens dubbel helix struktur. Tros ha fått hjälp av Franklin (& Wilkins).

DNA molekylens struktur

• DNA molekylen har en anti parallell struktur. Alltså 5’ och 5’ ändar vid motsatt sida.

• Strängarna sägs vara komplementära

• DNA-kedjorna består av sockerarten som binder till fosfatgruppen & kvävebas

• Dubbel helixen innehåller klyftor med olika storlek: lilla klyftan, minor grove. Stora klyftan, major grove. Tros spela en stor roll vid Replikation och transkription

Vilka typer av DNA finns det?

A-DNA: Finns i lösningar med låg vatten koncentration, har 11 baspar per varv, höger hänt.

B-DNA: finns i cellen när den inte transkriberas eller replikeras, har 10,5 baspar per varv, höger hänt.

Z-DNA: pro-, Eukaryoter, har 12 baspar per varv, vänster hänt

3 grundläggande regler som DNA molekylen följer vid replikation

• Är semikonservativ. Det innebär att de gamla DNA strängarna fungerar som mall för de nya. De två nya DNA-molekylerna består alltså av en gammal och en nysyntetiserad DNA sträng.

• Börjar vid specifik ursprungspunkt, Origin och sprider sig i två riktningar längs kromosomen

• Sker i 5’ → 3’ riktning. Det innebär att en fosfatgrupp med tillhörande deoxiribonukleotid fästs vis den nya strängens tredje kol. Mallsträngen läses 3’- 5’ riktning.

DNA- replikstionens 3 faser

1. Initiering, start av DNA syntes

2. Elongering, förlängning av ny DNA-sträng, en nukelotid i taget

3. Terminering (avslutning av replikationen)

Replikation, initiering

DNA- molekylen öppnas på ett origin kallar oriC som är 245 baspar långt. Helikas binder in till oriC och bryter vätebindningarna mellan de 2 DNA-strängarnas kvävebaser. Enzymet primas binder in (finns flera stycken) till båda DNA-strängarna och gör RNA-primers som är mellan 10-60 nukleotider lång. DNA-polymeras III binder till primern. Vid varje origin bildas en “bubbla” som kallas replikations gaffel dit SSBP (singel strand bindning protein) binder in och de håller strängarna separerade.

Replikation, Elongering

Helikas jobbar hela tiden med att bryta vätebindningarna mellan kvävebaserna i de två DNA strängarna. Eftersom DNA-molekylen är anti-parallell kommer replikationen se annourlunda ut för de två DNA strängarna.

Ledande strängen( den som följer helikas rikting) syntetiseras kontinuerligt utan avbrott. DNA polymeras III matchar rätt nukleotid mot ursprunglig sträng (rätt baspar) och syntetiserar bildandet av 3’-5’-fosfordiesterbindning

Släpande strängen syntetiseras i okasaki fragment (efter Regi Okasaki som upptäckte detta) Fragmenten sammanfogas senare. Primas binder in allt Primas binder in allteftersom helikas separerat fler nukleotider. Med jämna mellanrum syntetiserar primas en ny RNA-primer som DNA-polymeras III kan binda in till. När DNA polymeras III syntetiserat ny DNA sträng fram till tidigare primer släpper dem från molekylen.

För båda strängarna: DNA-polymeras binder in till alla RNA-primers och klipper bort RNA-nukelotiderna. Sen placerar den dit rätt DNA-nukleotid och syntetiserar bindningen mellan nukleotiderna. DNA ligas kommer och binder samman fragmenten som DNA-plymeras III har gjot med de fragmenten som DNA-polymeras I har gjort.

Replikation, Terminering

Replikationen avslutas när replikations gafflarna tillslut möts (helikas har gjort ett varv). För Eukaryoter är processen fortfarande relativt okänd

RNAs uppbyggnad

RNA= ribonukleicacid

RNA är uppbuggt av nukleotider som i sin tur består av:

• Sockerarten ribos

• Fosfatgrupper, 3 i fritt tillstånd, 1 i molekyl (RNA)

• Kvävebaserna, Uracin, Cytosin, Adenin, Guanin

A basparar med U( 2 vätebindningar), C basparar med G(3 vätebindningar)

Ribonukelotiderna binds samman genom en 3’-5’-fosfordiesterbindning. RNA är i stort sätt allttid elkelstrrängat men ibland kan delar av kedjan baspara ed sig självt, tex tRAN som är enkelsträngat men stundtals basparar med sig självt. RNA molekylen är helix formad

Olika typer av RNA

• tRNA (transfer RNA): transporterar aminosyror från cytoplasman till ribosomen, unik struktur som är ca 75 nukleotider långt.

• rRNA (ribosomalt RNA): 80% av cellens RNA är rRNA. bygger upp ribosomer ihop med proteiner. Har enzymatisk aktivitet och kan katalysera sin egen RNA syntes. Vilket har stor betydelse för evolutions teorin.

• mRNA(messanger RNA): “recept” på proteiner, skapas i transkriptionen.

Transkriptionen

Sker där DNA molekylen befinner sig, i cytoplasman hos bakterier och cellkärnan hos eukaryoter.

sker endast i 5’-3’ riktning

transkriptionen genomförs av RNA-polymeras ingen primer behövs och endast en del av genomet transkriberas.

Transkription, Initiering

DNA-molekylen rätas ut vid den gen som ska transkriberas. RNA-polymeras binder in till DNAts promotor. Promotorn har som uppgift att attrahera RNA-polymeras. Det finns många promotor regioner. Den första nukleotiden som transkriberas är 1+. Sedan transkriberas nukleotider medströms. promotor regionen ligger uppstörms. I E. coli finns två regioner vid -10 (TATA boxen) och - 35 regionen

RNA-ploymeraset binder lver både -35 regionen och TATA boxen det bildas ett stängt komplex. Sedan förflyttas RNA-polymeras till att enbart binda över TATA boxen och DNA-molkeylernas vätebindningar klipps upp så att den första (+1) nukleotiden kan transkriberas. Det har bildats en transkriptions bubbla.

Transkription, Elongering

RNA-polymeras kan avgöra vilken ribonukleotid som ska placeras i mRNAt utifrån vilken deoxiribonukleotid som sitter i DNAts “mallsträng”. ex:

DNA: 3’- ATGCCGTA -5’

mRNA:5’-UACGGAAU-3’←här sätts nya nukleotider fast.

RNA-polymeras transkriberas genen och bygger mRNA tills termineringen nås.

Transkription, Terminering

Inte fullständigt klarlagt i eukaryoter. I E. coli finns 2 sätt:

Rho oberoende: mRNA avslutas med ett långt palindrom så att en hårnålsögla bildas. Sedan har DNA en lång sträcka av A → lång sträcka U i mRNA. Hårnålsöglan och de “få” vätebindningar som finns mellan A&U leder till försvagad bindning mellan DNA& mRNA → MRNA lossnar.

Rho beroende: Palindrom i DNA → palindrom i RNA → hårnålsögla bildas. rho proteinet binder in till mRNA och glider längs den mot transkriotions bubblan.

Orsaker till mutationer

• Deaminering av cytosin(spontan reaktion)→Cytocins aminogruppp (-NH₂) byts ut mot dubbel bundet syre→ cytosin blir Uracil. Leder till felaktig basparning vid replikation/ transkription.

• UV-ljus → UV-ljusets energi orskar uppbrytning va bindning mellan kol i en kvävebas → bindning mellan 2 kvävebaser i samma DNA sträng. Oftast mellan 2 tymjner. Leder till felaktig avläsning vid replikation/ transkription.

• Kemikalier→ Alkylering (-R-CH₃), deaminering, DNA-härmande molekyler som alla leder till ffelaktig avläsning och därmed basparning vid transkription/ repliaktion.

Reparations system hos Escherishia coli

i och med att DNA är dubbelsträngat kan det repareras. Den ursprungliga strängen används som mall. För att cellen ska kunna avgöra vilken sträng som är den ursprungliga är A nukleotiden i sekvensen GATC alltid metylerad oavsett var i DNA strängen. Den nya strängen blir inte metylerad förrän några minuter.

Mismatch repair (system för att reparera felaktiga basparning under replikationen)

Reparerar alla fel utom 1 på 1000. Proteinet MutS identifierar och binder in till felaktig basparning. MutH binder in till den närmsta metylerade GATC sekvensen. Mut L binder in och sammanlänkar MutS& MutH. Komplexet MutHLS bildas. Mut HLS klipper upp den ny syntetiderade strängen, sedan kommer DNA-polymeras med exonukleasaktivitet att klippa bort felaktig sträng och syntetisera ny med rätt nukleotider. DNA ligas limmar ihop.

Base Exision Repair ( system för utskärning av felaktiga kvävebaser)

Sker vid vanliga felaktigheter so, Cytosin → Urasil. Enzymet glukoslyas känner igen felatig kvävebas och klipper bort den. Sockerfosfat-delen klipps bort av ett annat enzym- DNA.polymeras I sätter dit rätt nukloetid, DNA-ligas limmar ihop

Nukleotide exisison repair (mörker reaktion)

Lagar DNA-slador från UV-ljus & cigarett rök, Enzymerna UvrA, UVrB & UVrC hittar sakdan och klipper bort DNA-strängen (12-nukleotider lång) DNA-polymeras syntetiserar ny sträng, DNA ligas limmar ihop.

System för direkt (kemisk) reparation

Ingen bortklippning. Vis solljus kommer enzymet fotolyas att bryta bindningarna mellan 2 tyminer & återställa orginalbinf´dningar m.h.a ljus energi

Reglering av Transkription

Transkriptionen regleras mycket hårt då cellen inte vill spedera energi i onödan. Gener som transkriberas hela tiden kallas “hushållsgener” då de böhövs för cellens grundläggande processer.

Gener regleras genom:

1. Promotorn kan vara mer eller mindre atraktiv flr DNA-polymeras att binda in till. Om den ite är så atraktiv binder inte RNA-plymeras in lika ofta.

2. En receptor binder in till operatorn och hindarar på så sätt RNA-polymeras från att binda in. Repressorn blir av fysik blockad

3. En aktivator binder in vid promotorn. Det underlättar för RNA-polymeras som då lättare kan binda in till promotorn. Utan aktivator: inga transkriptioner.

Förändring efter transkriptionen

Den orognu RNA-molekylen förädndras efter transkriptionen hos i stort sätt pro- och eukaryoter.

Ex hos eukaryoter: icke kodande RNA (introner) klipps bort och extroner sammanfogas, kan antigen ske m.h.a. utomstående proteiner (snRNP:s) eller av RNA självt. Extronerna sammanfogas på olika sätt vilket gör att 1 gen kan ge upphov till många olika mRNA och sederav proteiner.

• Speciella kvävebaser läggs till i RNA.molekylens ände (kodar ej).

• 5’-huvu: en speciell nukleotid fästs med 5’-5’- trifosfatbindning i RNAs 5’ ände. Trolightvis ska detta hjälpa vid inbindning till ribosomen.

• poly-A-svans: Mellan 80-250 adenylat grupper fästs vid RNA:s 3’ ände förhindrar troligen nedbrytning av RNA.

Translation

• mRNA översätts till aminosyra sekvens & protein m.h.a den genetiska koden ( som är universell= likadan hos alla organismer)

• sker i cytoplasman hos prokaryoter & eukaryoter

• 3 kvävebaser = 1 kodon= 1 aminosyra. mRNA 300 nukleotider → 100 aminosyror

• 20 aminosyror - 61 kodon

• Flera aminosyror har flera kodon→ den genetiska koden är degenererad

• De olika kodonen för en aminosyra liknar varandra vilket minskar risken för allvarliga konsekvenser vid punkt mutation

• antalet kodon är relativt till hur vanlig aminosyran är i cellens proteiner.

• vid translation behövs: ribosom, tRNA, mRNA, aminosyrer, GTP, Proteinfaktorer

tRNA

tRNA har en speciell struktur. tRNA binder antiparallelt till mRNA. antikodon hos tRNA binder till respektive kodon i mRNA

Ribosom

Ribosomen består av en stor & litem subenhet. Den har 3 platser/säten/sites där rRNA kan binda in.

• A-plats(aminoacylsite)

• P-plats(peptidylsite)

• E-plats(exitsite)

Translationens 3 faser

I alla faser omvandlas GTP(guanintrifosfat) till GDP(Guanindifosfat) vilket frisätter energi till cellen.

1. initiering

2. Elongering

3. Terminering

translation, Initiering

Ribosomens lilla subenhet binder till mRNAs start kodon (hamnar i A-platsen) samtidigt binder en tRNA med rätt antikodon in till mRNA, tRNAt bär på en modifierad metonin. Stora subenheten binder in