elektroforeza - PAGE + SDS-PAGE

elektroforeza

polega na migracji naładowanych cząsteczek w kierunku elektrody o ładunku przeciwnym

od czego zależy szybkość wędrówki cząstek w elektroforezie?

• natężenie pola elektrycznego

• ładunek cząsteczki

• współczynnik tarcia

• siła jonowa elektrolitu

• pH, temperatura

od czego zależy szybkość wędrówki cząstek w elektroforezie SDS PAGE?

tylko od wielkości cząsteczki

cechy nośnika w elektroforezie

• elektrycznie obojętny

• nieaktywny chemicznie

• porowaty

• żel - działa jako sito molekularne i tłumi prądy konwekcyjne

żel poliakryloamidowy - składniki

• akryloamid

• bisakryloamind

• APS - nadsiarczan amonu

• TEMED

akryloamid

monomer poliakryloamidu, tworzy łańcuchy

bisakryloamid

(metylenobisakryloamid) - ko-monomer, czynnik sieciujący, łączy łańcuchy poliakryloamidu

APS i TEMED

nadsiarczan amonu + trzeciorzędowa amina, system kataliza/inicjacja, ułatwiają tworzenie wolnych rodników do polimeryzacji

PAGE - sieciowanie

im więcej bisakryloamidu, tym mniejszy por

PAGE - używane roztwory

żel poliakryloamidowy - zagęszczający/rozdzielający

bufor elektrodowy

bufor do analizy

żel zagęszczający

stacking gel, pH=6,8, nakładany na górę, dzięki niemu wszystkie białka dochodzą do żelu rozdzielającego w tym samym czasie

żel rozdzielający

separating gel, pH=8,8, umożliwia rozdzielenie białek w zależności od ich rozmiaru

bufor elektrodowy

running buffer, pH=8,3, glicyna, Tris, chlor

bufor do analizy, skład

= sample loading buffer

• SDS

• B-merkaptoetanol (BME)

• błękit bromofenolowy

• glicerol

SDS

sól sodowa siarczanu dodecylu

• niszczy oddziaływania niekowalencyjne w natywnych białkach

• ma silnie ujemny ładunek, ładuje białka ujemnie więc wszystkie idą do anody

B-merkaptoetanol/DTT

czynnik redukujący, zrywanie mostków disiarczkowych

błękit bromofenolowy, glicerol

barwienie/zwiększenie gęstości próbki