Hoofdstuk 6B: Recombinant DNA-technologie en genoomanalyse II

Flashcards met belangrijke termen en definities gerelateerd aan de technologie van recombinant DNA en genoomanalyse.

Recombinant DNA-technologie

Een technologie die gebruikt wordt om DNA uit verschillende bronnen te combineren.

Vectormolecuul

Een DNA-molecuul dat gebruikt kan worden om gensequenties te amplificeren.

Gencloning

De insertie van genetisch materiaal in een vector om specifieke genen te isoleren.

Dideoxy sequencing

Een methode voor DNA-sequencing die gebruik maakt van dideoxynucleotiden.

Southern blot

Een techniek om specifieke DNA-sequenties te detecteren na scheiding op een gel.

Agarose gel electrophoresis

Een methode om DNA-fragmenten te scheiden op basis van grootte.

cDNA

Complementair DNA dat wordt gesynthetiseerd van mRNA.

Gene therapie

Een behandelingsvorm waarbij genen worden gebruikt om ziekten te bestrijden.

Gelelectroforese

Een techniek waarbij DNA-fragmenten langs een gel bewegen onder invloed van een elektrische stroom.

Antibiotica-resistentiegen

Genen die resistentie bieden tegen antibiotica, vaak gebruikt als merker in genklonering.

DNA-ligase

Een enzym dat helpt bij het samensmelten van DNA-strengen.

Expressievector

Een vector die specifiek is ontworpen voor de expressie van een gen.

Faagvectoren

omvatten genetisch gemodificeerde stammen van becteriofaag Lambda, dubbelstrengig DNA-virus

• Genoom = gesequenced (multiple cloning site) + aangepast

• Inserts van kB kunnen dragen → grotere inserts dan bij plasmiden

Expressievectoren

Ze zijn beschikbaat voor zowel bacterieel als eukaryote gastheercellen en bevatten de juiste sequenties om zowel transcriptie als translatie van het gekloonde gen te initiëren

PCR

snelle methode voor DNA-klonering die de kracht van recombinant-DNA uitbreidt door herhaaldelijke cyclus van denaturatie, aanhechting en verlenging van DNA.

Benodigdheden PCR

• DNA-polymerase: Taq-polymerase

• Mg2+ = cofactor van DNA-polymerase

• dATP’s, dGTP’s, dCTP’s, dTTP’s

• 2 primers

Stappenplan PCR

1. Denaturatie: verhitting 92°-95°C → enkelstreng

2. Hybridisatie/Annealing: verlaging 54°-65°C → primerbinding aan het gedenatureerd enkelstrengig DNA

3. Extensie: verlenging van de nieuwe DNA-streng door DNA-polymerase bij 72°C.

Voor- en nadelen van PCR

Voordelen

• Snel

• Eenvoudig, weinig manipulaties

• Zeer gevoelig, weinig startmateriaal nodig

• Startmateriaal nog onzuiver, gedegradeerd zijn

Nadelen

• Gevoel: contaminatie

• Alleen bruikbaar voor fragmenten met gekende uiteinden

Restrictiekaart

geeft het aantal, de volgorde en de afstanden weer tussen restrictie-enzymknipplaatsen langs gekloond DNA-segment

Southern blotting

is een techniek voor het opsporen van specifieke DNA-sequenties in DNA-monsters na scheiding door gelelektroforese en overdracht naar een membraan, gevolgd door hybridisatie met een gelabeld DNA-probe.

Stappenplan Southern blotting

1. Scheiden van DNA

2. DNA geknipt met restrictie-enzymen + fragmenten isoleren door middel van gel-elektroforese

3. DNA-fragmenten in de gel wordt gedenatureerd door gel te weken in alkalische oplossing

4. Gel geplaatst op sponsachtige lont die in contact staat met bufferoplossing + bedekt met DNA-bindende membranen

5. Lagen blottingpapier boven op het membraan gelegd + verzwaard → buffer door de gel getrokken

6. DNA-fragmenten gehybridiseerd met DNA-probe

7. Membraan gewassen en bedekt met röntgenfilm voor audiografie → alleen fragmenten met probe zichtbaar

Stringente condities

probe zal alleen hybridiseren met het DNA-fragment dat volledig complementair is aan de probe

Niet-stringente condities

probe zal ook kunnen binden op plaatsen waar 1 of 2 niet-complementaire basen voorkomen

Nothern blotting (mRNA)

gebruikt om genexpressie te bestuderen door het scheiden van RNA-moleculen op basis van lengte, gevolgd door transfer naar een membraan en hybridisatie met specifieke probes.