CM3 - Technologie de l’ADN recombinant : étapes et outils

Partie 1 : Production de protéines recombinantes

I. II. La technologie de l’ ADN recombinant

• Qu’est-ce que la technologie de l’ADN recombinant ?

• Définir : ADN recombinant

• Définir : transgène

• Définir : protéine recombinante

• Quelles sont les étapes de production d’une protéine recombinante ?

• Combien de protéines recombinantes sont autorisées sur le marché en Europe ?

• Quelle a été la première protéine recombinante mise sur le marché ?

• C’est quoi l’ingénierie des protéines ?

1. Technologie de l’ADN recombinant
   Technique de laboratoire consistant à combiner de l’ADN de différentes origines et à l’introduire dans une cellule hôte afin de modifier génétiquement cette cellule et exprimer un gène d’intérêt.

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2. ADN recombinant
   Molécule d’ADN artificielle, formée in vitro, par association de séquences génétiques non naturellement associées.

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3. Transgène
   Gène étranger introduit dans le génome d’un organisme vivant.

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4. Protéine recombinante
   Protéine produite par une cellule hôte ayant reçu et exprimé un ADN recombinant.

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5. Étapes de production d’une protéine recombinante

6. Obtenir l’ADN codant la protéine

7. Insérer le gène dans une cellule hôte

8. Production de la protéine par la cellule

9. Extraction et purification de la protéine

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6. Nombre de protéines recombinantes autorisées en Europe
   ➡ Plus de 170 protéines recombinantes.

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7. Première protéine recombinante mise sur le marché
   ➡ Insuline humaine recombinante (1982).

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8. Ingénierie des protéines
   Discipline visant à modifier la structure d’une protéine pour améliorer ou créer de nouvelles fonctions (activité, stabilité, efficacité).

II. Outils du génie génétique : E. coli

Quelle est la bactérie modèle et pourquoi?

Escherichia coli : une bactérie modèle

• bactérie intestinale de l’être humain et des

animaux à sang chaud

• en général non pathogène

• découverte en 1885, ADN séquencé en 1997

• génome facilement mainpulable :

plasmides/transfert de gènes

• culture aisée (temps de division 20 min à 37°C)

• usines de production de plasmides ou de protéines

II. Outils du génie génétique : les plasmides

1. Définir : vecteur

2. Définir : plasmide

3. Quelles sont les caractéristiques générales des plasmides ?

4. Qu’est-ce qu’une carte plasmidique ?

5. Quels sont les deux types de plasmides artificiels ?

6. Quelles sont les différences entre les plasmides d’expression en bactérie et en levure ?

1. Vecteur

Structure biologique naturelle ou artificielle capable de véhiculer un ADN étranger dans une cellule.

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2. Plasmide

Molécule d’ADN extracromosomique, généralement circulaire double brin, capable de réplication autonome.

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3. Caractéristiques des plasmides

• ADN extracromosomique

• Double brin circulaire fermé

• Auto-réplicatif (1 origine de réplication)

• Souvent isolé sous forme superenroulée

• Confère un avantage sélectif (ex : résistance aux antibiotiques)

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4. Carte plasmidique

Représentation schématique d’un plasmide indiquant :

• Les sites de restriction

• Les gènes d’intérêt

• L’origine de réplication (ori)

• Le sens de transcription et de réplication

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5. Deux types de plasmides artificiels

• Plasmides de clonage

• Plasmides d’expression

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6. Différences plasmides d’expression bactérie / levure

En bactérie :

• Ori bactérien

• Promoteur bactérien (ex : T7)

• RBS

• Gène de résistance aux antibiotiques

En levure :

• Ori bactérien + ori levure (vecteur navette)

• Promoteur et terminateur de levure

• Marqueurs de sélection levure + bactérie

II. Outils du génie génétique : les enzymes

7. Définir : polymérase

8. Définir : nucléase

9. Définir : ligase

• Des enzymes qui copient les acides nucléiques (polymérases)

• Des enzymes qui coupent les acides nuléiques (nucléases)

• Des enzymes qui collent deux fragments d’acides nucléiques (ligases)

II. Outils du génie génétique : les polymérases

10. Comment fonctionnent les ADN polymérases in vivo ?

11. Combien y a-t-il d’ADN polymérases chez E. coli ?

12. Différences de rôle des ADN polymérases in vivo vs in vitro ?

13. Pourquoi les dNTP sont-ils essentiels ?

14. Quelles sont les caractéristiques de la polymérase utilisée pour la PCR ?

15. Donner les différents types de polymérases et leur fonction.

10. Fonctionnement des ADN polymérases in vivo

• Utilisent des dNTP

• Nécessitent une amorce ARN (synthétisée par la primase)

• Synthèse 5’ → 3’

• Activité exonucléasique pour la correction des erreurs

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11. ADN polymérases chez E. coli

➡ 3 ADN polymérases :

• ADN pol I

• ADN pol II

• ADN pol III

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12. Rôle in vivo vs in vitro

In vivo :

• ADN pol III : réplication de l’ADN

• ADN pol I et II : correction / réparation

In vitro :

• Les 3 peuvent synthétiser de l’ADN

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13. Rôle des dNTP

• Substrats nécessaires à la synthèse de l’ADN

• Leur absence entraîne une activité exonucléasique dégradant l’ADN

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14. Caractéristiques de la polymérase de PCR

• Stable à 95 °C

• Active à 72 °C

• Résiste aux cycles thermiques

• Ex : Taq polymérase

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15. Types de polymérases et fonctions

• ADN polymérases : synthèse d’ADN

• Transcriptase inverse : ARN → ADNc

• Terminal transférase : ajout de nucléotides en 3’

• Taq polymérase : amplification PCR

• T7 ADN polymérase : séquençage (faible fidélité)

II. Outils du génie génétique : les ligases

1. Définir : ADN ligase

2. Sur quels types d’extrémités l’ADN ligase peut-elle agir ?

3. Quelle est la différence entre ligases utilisant l’ATP et celles utilisant le NAD ?

1. ADN ligase

Enzyme qui catalyse la formation d’une liaison phosphodiester entre le 5’ phosphate et le 3’ OH de fragments d’ADN.

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2. Types d’extrémités reconnues par l’ADN ligase

• Bouts cohésifs (sticky ends)

• Bouts francs (blunt ends)

• Brèches sur un brin (nicks)

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3. Différence ligase ATP / NAD

• Ligases T4 et T7 : utilisent ATP

• Ligase d’E. coli : utilise NAD
  ➡ Les bouts francs ne peuvent être ligaturés que par une ligase ATP-dépendante

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II. Outils du génie génétique : les nucléases

4. Définir : nucléase

5. Quelle est la différence entre endonucléase et exonucléase ?

6. Quel est le rôle de l’exonucléase VII ?

7. Quel est le rôle de l’exonucléase III ?

8. Quel est le rôle des exonucléases λ et T7 ?

9. Quel est le rôle de la RNase H ?

10. Donner le rôle des nucléases suivantes :
    a. RNase A
    b. RNase T1
    c. DNase I
    d. Nucléase Bal31
    e. Nucléase S1

4. Nucléase

Enzyme de la classe des hydrolases qui coupe les acides nucléiques en rompant les liaisons phosphodiester.

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5. Endonucléase vs exonucléase

• Endonucléase : coupe à l’intérieur de la molécule

• Exonucléase : coupe à partir des extrémités (5’ ou 3’)

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6. Exonucléase VII

• Digère l’ADN simple brin en 5’ et 3’

• S’arrête au double brin

• Permet de créer des bouts francs

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7. Exonucléase III

• Digère l’ADN double brin de 3’ vers 5’

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8. Exonucléases λ et T7

• Digèrent l’ADN double brin de 5’ vers 3’

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9. RNase H

• Endonucléase détruisant les amorces ARN

• Utilisée après synthèse d’ADNc pour éliminer l’ARN matrice

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10. Autres nucléases

a. RNase A

• Digère l’ARN simple brin

• Hydrolyse entre P et C5’

b. RNase T1

• Hydrolyse l’ARN en aval des G

c. DNase I

• Endonucléase de l’ADN simple et double brin

• Coupe de manière aléatoire

• Utilisée pour créer des brèches

d. Nucléase Bal31

• Exonucléase mange les extrémités 3’

• Crée des brins 5’ sortants

• Digère ensuite l’ADN simple brin

• Peut tout digérer

e. Nucléase S1

• Spécifique des simples brins ADN ou ARN

• Utilisée pour créer des bouts francs

II. Outils du génie génétique : enzymes de restriction

1. Définir : enzyme de restriction

2. En quoi consiste le système restriction–modification bactérien ?

3. Pourquoi l’ADN bactérien n’est-il pas digéré par ses propres enzymes de restriction ?

4. Quelles séquences sont reconnues par les enzymes de restriction ?

5. Pourquoi la plupart des sites de restriction sont-ils palindromiques ?

6. Qu’est-ce qu’un fragment de restriction ?

7. Quels sont les trois types d’extrémités générées par les enzymes de restriction ?

1. Enzyme de restriction

Endonucléase qui coupe les deux brins d’ADN après reconnaissance d’une séquence spécifique (site de restriction).

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2. Système restriction–modification

Système de défense bactérien contre les bactériophages associant :

• enzymes de restriction (digestion ADN étranger)

• enzymes de méthylation (protection ADN bactérien)

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3. Protection de l’ADN bactérien

Les bases des sites de restriction sont méthylées, empêchant la coupure.

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4. Séquences reconnues

Séquences spécifiques de 4, 6 ou parfois 8 nucléotides.

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5. Séquences palindromiques

Les enzymes de restriction sont dimériques et reconnaissent des séquences lues identiquement en 5’→3’ sur les deux brins.

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6. Fragment de restriction

Fragment d’ADN obtenu après digestion par une enzyme de restriction.

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7. Types d’extrémités

• Extrémités cohésives 5’ sortantes

• Extrémités cohésives 3’ sortantes

• Extrémités franches

II. Outils du génie génétique : kinases et phosphatases

8. Quel est le rôle général des kinases et des phosphatases ?

9. Quel est le rôle de la T4 polynucléotide kinase ?

10. Quel est le rôle de la phosphatase alcaline ?

8. Rôle kinases / phosphatases

Enzymes modifiant l’ADN ou l’ARN en ajoutant ou retirant un phosphate en 5’.

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9. T4 polynucléotide kinase

Transfère le phosphate γ de l’ATP sur le OH en 5’ des acides nucléiques.
➡ Nécessite Mg²⁺

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10. Phosphatase alcaline

Déphosphoryle les extrémités 5’.
➡ Empêche la religation d’un vecteur.
➡ Enzyme Zn²⁺ dépendante

III. Techniques de biologie moléculaire : PCR

11. Définir : PCR

12. Définir : ADN matrice

13. Définir : amorces de PCR

14. Définir : amplicon

15. Quel est le rôle des amorces dans la PCR ?

16. Quelles sont les caractéristiques générales des amorces de PCR ?

17. Pourquoi utilise-t-on une polymérase thermorésistante ?

18. Quelles sont les caractéristiques de la Taq polymérase ?

19. Quelles sont les caractéristiques de la Pfu polymérase ?

20. Pourquoi utiliser des mélanges Taq + Pfu ?

21. Quelle est la particularité de la KOD polymérase ?

22. Pourquoi l’ajout d’un A en 3’ par la Taq est-il utile en clonage ?

11. PCR

Technique d’amplification in vitro d’un ADN cible à l’aide d’une polymérase, d’amorces et de nucléotides.

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12. ADN matrice

ADN source contenant la séquence cible à amplifier.

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13. Amorces de PCR

Courts oligonucléotides ADN simple brin servant de point de départ à la synthèse.

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14. Amplicon

Fragment d’ADN délimité par les amorces, produit de l’amplification PCR.

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15. Rôle des amorces

• S’hybrident aux extrémités 3’

• Délimitent la région amplifiée

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16. Caractéristiques des amorces

• Longueur : 15–30 nucléotides

• Tm proches (±5 °C)

• %GC : 40–60 %

• Pas de dimères ni hairpins

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17. Polymérase thermorésistante

Résiste aux cycles de dénaturation à haute température.

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18. Taq polymérase

• Rapide

• Peu fidèle (1 erreur / 1000 pb)

• Pas d’activité exo 3’→5’

• Ajoute un A en 3’

• Fragments ≤ 6 kb

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19. Pfu polymérase

• Lente

• Très fidèle (1 erreur / 10 000 pb)

• Activité exonucléasique

• Produit des bouts francs

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20. Mélanges Taq + Pfu

Compromis entre vitesse et fidélité, bouts francs.

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21. KOD polymérase

• Très rapide

• Fragments longs (<21 kb)

• Bouts francs

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22. Intérêt du A en 3’

Permet le clonage TA dans des vecteurs portant un T en 5’.

III. Techniques de biologie moléculaire : RT-PCR

23. Définir : RT-PCR

24. Quelles sont les deux étapes de la RT-PCR ?

23. RT-PCR

Technique permettant de faire une PCR à partir d’ARN.

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24. Étapes RT-PCR

1. Transcription inverse (ARN → ADNc)

2. PCR classique

III. Techniques : introduction d’ADN exogène dans les cellules

25. Définir : transformation

26. Définir : transfection

27. Définir : transduction

28. En quoi consiste la transformation chimique CaCl₂ / choc thermique ?

29. En quoi consiste l’électroporation ?

25. Transformation

Introduction d’ADN ou ARN exogène dans des cellules bactériennes ou végétales.

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26. Transfection

Introduction d’acides nucléiques dans des cellules eucaryotes animales.

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27. Transduction

Transfert d’ADN exogène via un vecteur viral.

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28. Transformation CaCl₂ / choc thermique

Ca²⁺ neutralise les charges → choc thermique → nanopores transitoires.

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29. Électroporation

Champ électrique créant des pores membranaires réversibles.

III. Techniques de purification des acides nucléiques : ADN génomique

30. Quelles sont les grandes étapes de purification de l’ADN génomique ?

31. Quel est le rôle de la protéinase K ?

32. Quel est le rôle de la RNase A ?

33. Pourquoi utilise-t-on l’isopropanol lors de la purification ?

30. Étapes purification ADN génomique

• Lyse cellulaire

• Déprotéinisation

• Digestion ARN

• Précipitation

• Lavage / réhydratation

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31. Protéinase K

Dégrade les protéines et nucléases.

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32. RNase A

Dégrade les ARN.

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33. Isopropanol

Permet la précipitation de l’ADN.

III. Techniques : purification d’acides nucléiques sur support solide

1. Quelles sont les grandes étapes d’une purification sur support solide ?

2. Sur quoi repose la chromatographie sur phase de silice ?

3. Sur quoi repose la chromatographie échangeuse d’ions ?

4. Sur quoi repose la chromatographie d’affinité ?

1. Étapes purification sur support solide

• Lyse / homogénéisation

• Fixation des acides nucléiques

• Lavages

• Élu­tion

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2. Chromatographie sur silice

Fixation de l’ADN via liaisons hydrogène en présence de sels chaotropiques (guanidinium), élution à l’eau.

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3. Chromatographie échangeuse d’ions

Interaction par liaisons ioniques, élution par variation de pH ou de force ionique.

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4. Chromatographie d’affinité

Fixation spécifique via interaction ligand–cible, élution par eau ou changement de pH.

III. Techniques de purification d’acides nucléiques : Miniprep

5. Quel est le principe général de la miniprep plasmidique ?

6. Quelles sont les étapes clés de la miniprep ?

7. Quel est le rôle du SDS et du NaOH ?

8. Quel est le rôle de la neutralisation acide (acétate de potassium) ?

9. Pourquoi l’ADN plasmidique reste-t-il en solution après neutralisation ?

5. Principe de la miniprep

Isolation rapide de l’ADN plasmidique à partir de bactéries par lyse alcaline sélective.

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6. Étapes de la miniprep

• Resuspension

• Lyse alcaline

• Neutralisation

• Centrifugation

• Précipitation

• Lavages

• Resuspension

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7. Rôle SDS / NaOH

• SDS : lyse des membranes

• NaOH : dénaturation ADN et protéines

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8. Rôle neutralisation acide

Précipite ADN génomique, protéines et membranes sous forme de culot.

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9. ADN plasmidique en solution

ADN circulaire superenroulé renature correctement après neutralisation.

III. Dosage, pureté et intégrité des acides nucléiques

10. Définir : absorbance (A) ou densité optique (DO)

11. À quelle longueur d’onde absorbent les acides nucléiques ?

12. À quelle longueur d’onde absorbent les protéines ?

13. Comment calculer la concentration en ADN ou ARN à partir de A260 ?

14. À quoi servent les rapports A260/A280 et A260/A230 ?

10. Absorbance (DO)

Mesure de la capacité d’une solution à absorber la lumière à une longueur d’onde donnée.

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11. Absorption des acides nucléiques

➡ 260 nm

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12. Absorption des protéines

➡ 280 nm

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13. Calcul concentration

• ADN double brin : C = A260 × 50 µg/mL

• ADN simple brin : C = A260 × 33 µg/mL

• ARN : C = A260 × 40 µg/mL

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14. Rapports de pureté

• A260/A280 : contamination protéique

• A260/A230 : contamination organique (phénol, sels)

IV. Étapes globales du clonage moléculaire

15. Quelles sont les grandes étapes d’un projet de clonage ?

Étapes globales clonage

1. Préparer l’ADN cible

2. Stratégies de clonage

3. Montage d’expression

4. Optimisation production

5. Ingénierie génétique

6. CRISPR/Cas9

IV. Étape 1 : Préparer l’ADN cible

16. Quelles sont les étapes de préparation de l’ADN génomique procaryote ?

17. Quel est le rôle du lysozyme ?

18. Quel est le rôle de la protéinase K ?

19. Quel est le rôle de la RNase A ?

16. Préparation ADN génomique procaryote

• Culture bactérienne

• Lyse (lysozyme)

• Protéinase K

• RNase A

• Extraction phénol/CHCl₃

• Précipitation EtOH

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17. Rôle du lysozyme

Digère la paroi bactérienne.

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18. Rôle protéinase K

Dégrade les protéines et nucléases.

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19. Rôle RNase A

Dégrade les ARN.

IV. Étape 1 : Préparation du cDNA eucaryote

22. Comment est synthétisé le cDNA à partir du mRNA ?

23. Pourquoi faut-il que le gène soit exprimé dans l’échantillon de départ ?

22. Synthèse du cDNA

• Transcriptase inverse

• Amorçage par oligo-dT

• Destruction du mRNA

• Synthèse du brin complémentaire ou PCR

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23. Expression préalable du gène

Le mRNA n’est présent que si le gène est exprimé.

IV. Étape 1 : Synthèse de gène

24. En quoi consiste la synthèse chimique d’un gène ?

24. Synthèse de gène

Assemblage chimique d’oligonucléotides par cycles successifs.

IV. Étape 2 : Construction du plasmide recombinant (clonage)

25. Définir : clonage moléculaire

26. Qu’est-ce qu’un plasmide recombinant ?

27. Qu’est-ce qu’une colonie bactérienne clonale ?

28. Quelles sont les étapes d’un clonage moléculaire classique ?

25. Clonage moléculaire

Insertion d’un fragment d’ADN d’intérêt dans un vecteur plasmidique pour amplification.

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26. Plasmide recombinant

Plasmide contenant un ADN étranger inséré.

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27. Colonie clonale

Population de bactéries génétiquement identiques issues d’une seule cellule transformée.

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28. Étapes du clonage moléculaire

1. Construction plasmide recombinant

2. Transformation bactérienne

3. Sélection sur antibiotique

4. Analyse des colonies (miniprep, digestion, séquençage)