🌱🦠 Mikrobiologia - 🔬🧫 Laby - ⚔️🦠 Praca z bakteriofagami

Letkiewicz-approved flashcards...

🧬🚫 Nie.

Wirusy nie replikują się poza żywymi komórkami, dlatego do ich badania niezbędne jest wykorzystanie odpowiedniego gospodarza (bakterii, zwierząt, roślin lub hodowli tkankowych).

❓🧫 Czy wirusy można namnażać na standardowych pożywkach mikrobiologicznych tak jak bakterie?

📉🦠 Spadek gęstości optycznej (zmętnienia).

Początkowo gęstość rośnie (bakterie się dzielą), ale gdy namnożone wirusy powodują masową lizę komórek, hodowla staje się klarowna.

❓👀 Co obserwuje się w płynnej hodowli bakteryjnej, gdy dochodzi do skutecznego namnożenia bakteriofagów i lizy bakterii?

🔢⚖ 1 cząstka faga na 10–100 komórek bakterii.

Taka proporcja jest zalecana na początku hodowli.

❓📏 Jaki powinien być stosunek liczby cząstek faga do liczby komórek bakterii na początku namnażania w hodowli płynnej?

🧪💀 Dodaje się kilka kropli chloroformu.

Zabija on niezlizowane jeszcze bakterie i uwalnia z nich fagi.

❓💧 Co robi się z hodowlą płynną, gdy spadek gęstości staje się ewidentny, aby zakończyć proces?

🛡🚫 Dla fagów osłonkowych (np. M13).

Chloroform inaktywuje wirusy posiadające osłonkę lipidową.

❓⚠ Dla jakich wirusów nie wolno stosować chloroformu podczas izolacji?

🔄🌪 Wirowanie (usunięcie resztek bakterii w osadzie) oraz sączenie (przez filtr 0,22 µm).

❓🧹 Jakie dwa etapy oczyszczania stosuje się, aby uzyskać czystą zawiesinę wirusów (supernatant) wolną od komórek bakteryjnych?

🍰🔢 Metoda płytek dwuwarstwowych.

Wykorzystuje ona podłoże stałe (spód) i półpłynne (w którym zawieszone są bakterie i fagi).

❓🍽 Jaka metoda służy do określania liczby cząstek fagowych (miana faga) oraz izolowania czystych klonów?

🎯📉 Miano faga.

Jest to liczba cząstek fagowych znajdujących się w 1 ml uzyskanej zawiesiny.

❓🏷 Jak w mikrobiologii nazywa się określenie liczby wirusów w jednostce objętości?

🍽🌑 Określanie morfologii łysinek fagowych.

Łysinki to puste placki na murawie bakteryjnej, gdzie wirusy zabiły bakterie.

❓👁 Co (oprócz liczenia wirusów) umożliwia ocenić metoda płytek dwuwarstwowych?

🧬🧪 Tylko w żywych komórkach bakterii.

Nie namnażają się one na samych pożywkach, dlatego do hodowli niezbędny jest szczep odpowiedniego gospodarza wrażliwego na danego wirusa.

❓🦠 W czym wyłącznie namnaża się bakteriofagi?

🛡🚫 Dla fagów osłonkowych (np. M13).

Chloroform inaktywuje wirusy posiadające osłonkę lipidową, dlatego w ich przypadku pomija się ten krok.

❓⚠ Dla jakich wirusów nie wolno stosować chloroformu podczas izolacji?

🔄🌪 Wirowanie.

Pozwala ono usunąć resztki bakterii, które opadają na dno jako osad. Fagi pozostają w płynie nad osadem (supernatancie).

❓🧪 Jaki jest pierwszy etap oczyszczania zlizowanej hodowli po dodaniu chloroformu?

🕸🤏 Filtracja przez pory 0,22 µm.

Pozwala to usunąć wszystkie pozostałe bakterie, przepuszczając jedynie cząstki wirusowe (jest to szczególnie ważne dla fagów M13 i osłonkowych).

❓🔬 Jaki proces (i o jakiej średnicy porów) stosuje się, aby ostatecznie oddzielić fagi od bakterii?

🏷🧪 Miano faga.

Jest to liczba cząstek fagowych znajdujących się w 1 ml uzyskanej zawiesiny.

❓📊 Jak nazywa się parametr określający liczbę cząstek wirusowych w jednostce objętości?

🍰🔢 Określanie liczby infekcyjnych wirusów.

🦠📈 Namnażanie bakteriofagów.

🧬🔍 Izolowanie czystych klonów fagów.

👁📝 Określanie morfologii łysinek fagowych.

❓🧪 Do jakich czterech celów stosuje się metodę płytek dwuwarstwowych w pracy z bakteriofagami?

🧱💧 Podłoże stałe (spód, 1,5% agaru) oraz podłoże półpłynne (wierzchnia warstwa, ok. 0,45–0,7% agaru).

Warstwę półpłynną wylewa się na powierzchnię stałej.

❓🍽 Jakie dwa rodzaje podłoża (o jakiej konsystencji) wykorzystuje się w tej metodzie?

🌡⏳ Adsorpcja wirusów.

Inkubuje się mieszaninę, aby każdy z wirusów miał szansę przyczepić się (zaadsorbować) do bakterii przed wylaniem na płytkę.

❓🛑 Jaki proces musi zajść w probówce z bakteriami i rozcieńczonymi fagami zanim doda się agar i wyleje na płytkę?

🌡🌡 Około 45°C.

Agar musi być płynny, ale nie może być zbyt gorący, aby nie zabić bakterii i wirusów.

❓🔥 Do jakiej temperatury musi być schłodzony upłynniony agar półpłynny przed dodaniem do probówki z bakteriami i fagami?

🌱🟩 Murawa bakteryjna.

Powstaje ona w wyniku namnożenia się ogromnej liczby niezaifekowanych bakterii w warstwie półpłynnej (zmętnienie).

❓🌿 Co tworzą na płytce bakterie, które nie zostały zainfekowane przez fagi?

🌑🕳 Łysinka fagowa (ang. plaque).

Jest to przejaśnienie w murawie bakteryjnej, powstałe w miejscu, gdzie bakterie zostały zlizowane (zabite) przez wirusy.

❓⭕ Jak nazywa się puste miejsce (przejaśnienie) w murawie bakteryjnej, będące efektem działania bakteriofagów?

🦠👆 Od jednej cząstki wirusowej.

Przyjmuje się, że każda łysinka jest wynikiem infekcji zapoczątkowanej przez pojedynczego faga (klon).

❓🧬 Od ilu cząstek fagowych pochodzi (teoretycznie) jedna łysinka widoczna na płytce?

🔢📉 pfu (ang. plaque forming units),

czyli jednostki tworzące łysinkę (w przeliczeniu na 1 ml próbki).

❓📏 W jakich jednostkach podaje się wynik liczbowy (miano faga) w metodzie płytek dwuwarstwowych?

🧬🐑 Tak.

Pobierając materiał z pojedynczej łysinki, otrzymuje się potomstwo jednego wirusa, czyli czystą linię genetyczną (analogicznie do pojedynczej kolonii bakterii).

❓🧪 Czy metoda ta pozwala na uzyskanie czystych klonów wirusa (czystych kultur)?

👁📏 Wielkością i stopniem przejrzystości.

Łysinki mogą być duże lub małe, klarowne lub mętne, co pozwala odróżniać różne gatunki fagów.

❓🔍 Jakimi cechami morfologicznymi mogą różnić się łysinki fagowe?

❄🌡 4–8°C.

Pozwala to na przechowywanie przez kilka tygodni, a niekiedy miesięcy (zależnie od mikroorganizmu) na płytkach lub skosach.

❓🌡 W jakiej temperaturze przechowuje się bakterie na podłożach stałych przez krótki czas (tygodnie/miesiące)?

🧪💉 Słupki z podłożem półpłynnym.

Szczepi się je poprzez wkłucie. Jeśli zabezpieczy się je przed wysychaniem, bakterie takie jak E. coli mogą przetrwać w nich przez lata.

❓⏳ Jaki rodzaj hodowli (typ podłoża i naczynia) jest wskazany do dłuższego przechowywania bakterii bez zamrażania?

🧊💨 Liofilizacja.

Polega na usunięciu wody z zamrożonych zawiesin poprzez sublimację w warunkach obniżonego ciśnienia.

❓🔬 Na czym polega proces uznawany za jedną z najlepszych metod przechowywania mikroorganizmów?

🍼🍬 Czynniki krioprotekcyjne.

Przykłady stosowane w ATCC to odtłuszczone mleko lub sacharoza.

❓🛡 Co należy dodać do hodowli przed liofilizacją, aby ochronić komórki?

🚫☀ Tlenu, wilgoci i światła.

W takich warunkach zliofilizowane komórki (i bakteriofagi) mogą przetrwać ponad 50 lat.

❓🕰 Przed działaniem jakich trzech czynników należy chronić liofilizaty, aby mogły być przechowywane przez dekady?

❄📉 W temperaturze -70°C.

Wymaga to dodania krioprotektantów do gęstej hodowli.

❓🥶 W jakiej temperaturze zazwyczaj przechowuje się szczepy w postaci zamrożonej w standardowych zamrażarkach laboratoryjnych?

🧪🛡 Glicerol (10%) lub DMSO (5%).

(DMSO = dimetylosulfotlenek). Dodaje się je do gęstej hodowli przed zamrożeniem.

❓💧 Jakie dwa związki (krioprotektanty) i w jakich stężeniach końcowych dodaje się do hodowli przed jej zamrożeniem w -70°C?

🌡❄ Ciekły azot (-196°C).

W ATCC przechowuje się w ten sposób szczepy, których nie udawało się przechowywać jako liofilizaty.

❓🌡 Jaka metoda przechowywania zapewnia jeszcze niższą temperaturę niż zamrażarki i jest stosowana dla szczepów trudnych w liofilizacji?

🦠✅ Tak.

Te same metody (liofilizacja, mrożenie z krioprotektantami) stosuje się do bakteriofagów.

❓🧬 Czy opisane metody przechowywania bakterii (liofilizacja, mrożenie) można stosować również do bakteriofagów?

💧🔄 Ponowne uwodnienie.

Po dodaniu wody materiał odzyskuje postać i właściwości, co pozwala na założenie hodowli.

❓🚿 Jaki proces należy przeprowadzić z liofilizatem, aby „ożywić” mikroorganizmy przed posiewem?