FLUORESCENČNÁ MIKROSKOPIA (+ laserová skenovacia konfokál. mikroskopia)

Na akom princípe je založená väčšina bežne dostupných fluorescenčných mikroskopov?

Na princípe epi-fluorescencie.

Akú funkciu plní šošovka objektívu pri epi-fluorescenčnom mikroskope?

Slúži súčasne ako kondenzor, ktorý zabezpečuje dostatočné osvetlenie objektu, a zároveň ako objektív, ktorý umožňuje zachytenie emitovaného svetla aj pri vyšších numerických apertúrach.

Aké svetelné zdroje sa najčastejšie používajú v bežnej fluorescenčnej mikroskopii?

Najčastejšie sa používa ortuťová výbojka alebo xenónová lampa, v poslednom čase sa využívajú aj monochromatické LED diódy.

Aké sú výhody použitia LED diód ako zdroja svetla vo fluorescenčnej mikroskopii?

Ich výhodou je kompaktná veľkosť, nízka spotreba energie, minimálny výdaj tepla, vysoká emisná stabilita a dlhá životnosť.

Čo slúži ako zdroj svetla v prípade konfokálnej fluorescenčnej mikroskopie?

Laser o definovanej vlnovej dĺžke (napr. argónový, kryptónový atď.).

Ako prechádza svetlo v epi-fluorescenčnom mikroskope od zdroja k pozorovateľovi?

Svetlo prechádza excitačným filtrom a pomocou dichroického zrkadla sa odráža na objekt. Emitované svetlo z fluorochrómu prechádza objektívom späť cez dichroické zrkadlo a emisný (bariérový) filter do okuláru.

Z čoho sa skladá takzvaný filter blok vo fluorescenčnom mikroskope?

Skladá sa zo špecifickej sady excitačných, dichroických a emisných filtrov pre danú skupinu fluorochrómov.

Aké sú výhody použitia epifluorescenčného mikroskopu?

• vysoká citlivosť a vysoký kontrast
• zlepšenie pomeru signál:šum
• vysoká špecificita detekcií
• rýchlosť, relatívna nenáročnosť
• znížená deštrukcia biologických modelov

Aké sú komplikujúce faktory pri použití epifluorescenčného mikroskopu?

• finančné náklady na obstaranie celého zariadenia a pokrytie jeho prevádzky
• vyhasínanie fluorescencie
• znížená axiálna rozlišovacia schopnosť
• tvorba artefaktov

Aký excitačný zdroj využíva laserová skenovacia konfokálna mikroskopia (LSCM)?

Využíva tenký laserový lúč o špecifickej vlnovej dĺžke, ktorý je zaostrený do podoby bodu v jednej rovine ostrosti pozorovaného objektu.

Akú funkciu má konfokálna apertúra (emisná štrbina) v LSCM?

Je predradená pred fotonásobičom a nastavená tak, aby fluorescenčné svetlo, ktoré nepochádza z ohniskovej roviny, touto štrbinou neprešlo, čím dochádza k redukcii neostrého pozadia.

Ako sa zobrazuje obraz u LSCM, keďže ho nie je vidieť priamo v objektíve?

Fotonásobič zaznamenáva rôzne svetelné intenzity a prevádza ich do riadkových informácií pomocou počítača, pričom celý skenovací proces sa zobrazuje na obrazovke.

Aké sú výhody použitia konfokálneho mikroskopu?

• zníženie neostrosti finálneho obrazu potlačením rozptylu svetla
• zlepšenie pomeru signál:šum
• možnosť 3D alebo 4D rekonštrukcie pozorovaného objektu skladaním jednotlivých optických rezov
• vysoká citlivosť a rozlišovacia schopnosť
• redukcia interferencie medzi spektrami fluorochrómov (cross-talk alebo bleed-through)

Aké sú komplikujúce faktory pri použití konfokálneho mikroskopu?

• finančné náklady na obstaranie zariadenia a pokrytie jeho prevádzky
• pracnosť a náročnosť práce so zariadením
• rýchle vyhasínanie fluorescencie kvôli sústredeniu excitačného svetla do veľmi malej plochy vyšetrovanej vzorky
• interpretácia výsledkov