Bioteknik - kursprov

Det centrala dogmat

genetisk kod: universiell

Det molekylära informationssystemet för alla levande organismer (+ virus).
Alla celler har samma sorts molekyler, dvs använder samma språk för att utbyta information.

Deoxiribonukleinsyra uppbyggnad

Deoxiribonukleotider:

• Deoxiribos. Fosfatgrupp p. kol 5, kvävebas kol 1, fosfatgrupp från annan nukleotid kol 3

• Kvävebaser
  Pyriminer (6-kolsringar) Cytosin & Tynin
  Puriner (5-&-6-kolring förening) Adenin & Guanin

• Fosfatgrupper, 3 st i fritt tillstånd, 1 i molekyl

Pyrimider

6 kolsring
- Cytosin
- Tyanin

Puriner

5 & 6 kolsring i förening
- Adenin
- Guanin

Deoxiribonukleotiderna binder till varandra

2 fosfatgrupper spjälkast bort. Fosfatgruppen binder till nästa nukleotids 3:dje kol och en
3’-'5’-fosfodiesterbindning skapas. Pga detta på strängen en 5’ ände med 3 fosfatgrupper och en 3’ ände med OH-grupp

Basparning i DNA

Adenin - tynin, 2 vätebindningar
Cytosin - guanin, 3 vätebindningar
0,34 nm mellar baspar

Chargaffs regel; mängd A = T & G = C, tsm 100%

DNA molekylens uppbyggnad - upptäckt

1953, Watson & Crick, tros fått hjälp av Frankkling (& Wilkins)

DNA molekylens uppbyggnad, Watson & Cricks upptäckt

DNA molekylen är antiparallell, dvs 3’ och 5’ ändar i motsatt rikting. Sägs vara komplementära

Dubbelhelixens klyftor

Lilla (minor) och stora (major) klyftan (groove)

Tros spela stor roll i replikation & transkription

1 period

Periodicitetens längd, 3,6 nm

A-DNA

Finns i cellen, inte vid transkription eller replikation
10,5 baspar/varv
Högerhänt vriden

B-DNA

I lösningar med låg koncentration vatten
11 baspar/varv
Högerhänt vriden

Z-DNA

Naturligt hos pro&eukaryoter
12 baspar/varv
Vänsterhänt vriden

3 grundläggande regler för replikation

• Semikonservativ, den gamla DNA-strängen fungerar som mall för den nya. De 2 nya DNA molkeylerna består av en gammal sträng & en nysyntetiserad sträng

• Börjar vid specifik ursprungspunkt, Origin, sprider sig i 2 riktningar längs kromosomen

• 5’→ 3’ riktning, 1 fosfatgrupp med tillhörande deoxiribonukleotid fästs vid den nya strängens 3dje kol. Mallsträngen läses 3’→5’ rikting

DNA-replikationens faser

1. Initiering

2. Elongering

3. Terminering

DNA-replikation; Initiering

DNA-molekylen öppnas på origin platsen kallad Ori C som är 245 barspar lång.

Helikas binder till Ori C och bryter vätebindningar mellan basparen mellan DNA strängarna. Enzymet Primas binder in till båda strängarna och gör RNA-primers som är 10-60 nukleotider lån. DNA-polymeras III binder in till primern vid varje origin och bildar en bubbla, sk replikationsgaffel, ditSSBP binder in och håller strängarna separerade

DNA-replikation; elongering

Helikas jobbar hela tiden med att bryta vätebindingar mellan kvävebaserna i DNA strängarna. Pga DNA-molekylen antiparallell kommer replikation ske annorlunda för de 2 strängarna

• Ledande sträng, följer helikas riktning och syntetiseras utan avbrott. DNA-polymeras II matchar rätt nikleotid mot ursprungliga sträng och syntetiserar bildandet av 3’→ 5’-fosfodiesterbindning

• Släpande sträng, syntetiseras i Okazakifragment som senare sammanfogas. Primas binder in allt eftersom helikas separerat fler nukleotider, med jämna mellanrum skapas nya RNA-primers

DNA-polymeras I binder in till alla RNA-primers och klipper bort RNA-nukleotiderna och placerar dit rätt DNA-nukleotid & syntetiserar bindningar. DNA-ligas binder samman fragmenten

DNA-replikation; terminering

Replikationen avslutas när replikationsgaffeln till slut möts, dvs helikas har gått ett varv

Semikonservativ

Vid replikering består varje ny DNA-molekyl av en gammal sträng och en nysyntetiserad sträng.

Konservativ replikering

Den ursprungliga DNA-molekylen förblir oförändrad och ny DNA-molekyl bildas utan innehåll av någon gammal del

Dispersiv replikering

Varje ny DNA-molekyl består av sektioner gammal DNA-sträng och sektioner nysyntetiserad DNA-sträng, allt slumpvis

RNA-nuknukleotiders uppbyggnad

• Ribos, kol 1; kvävebas. Kol 2 & 3; OH, Kol 3; fosfatgrupp från annan nukletid. Kol 5; fosfatgrupp/er

• Fostfatgrupper, 3 st fritt, 1 molekyl

• Kvävebaser (samma som DNA, men T = U)

tRNA

Transfer-RNA, transporterar aa f. cytoplasma till ribosom. Unik struktur & är ca 75 nukleotider lång

rRNA

Ribosomalt-RNA, 80% cellers RNA. Bygger upp ribosomer tsm m proteiner. Har enzymatisk aktivitet & kan katalysera sin egen RNA-syntes; stor betydelse för evolutionsteorin.

mRNA

messenger-RNA, “recept” på proteiner. SKapas i transkriptionen

Transkription

• Sker där DNA-molekylen är. Cytoplasman hos bakterier och cellkärnan hos eukaryoter

• Sker endast 5’→3’ riktning

• Transkription genomförs av RNA-polymeras, ingen primer behövs & endast del av genomet transkriberas

Transkription; initiering

DNA molekylen rätas ut vid den gen som ska transkriberas. RNA-polymeras binder t DNA:ts promotor.
Promotorns uppgift: attrahera RNA-polymeras. Finns många promotorregioner.
Den första nukleotien som transkriberas = +1, sedan transkriberas nukleotiderna nedströms. Promotorregionen ligger uppströms. I E. Coli finns 2 regioner v -10 (TATA-boxen) & -35-regionen

RNA-polymeraset binder över både -35 regionen och TATA boxen, ett stängt komplex bildas. Sedan förflyttas RNA-polymeras till att enbart binda över TATA-boxen & DNA-molekylens vätebindningar klipps s.a. d. första (+1) nukleotiden transkriberas & transkriptionsbubbla bildas

Transkription; elongering

RNA-polymeras kan avgöra vilken ribonukleotid som ska placeras i mRNA:t utifrån vilken deoxiribonukleotid som sitter på DNA:ts “mallsträng”. RNA-polymerastranskriberar genen & bygger mRNA till terminering nås

Transkription; terminering

E coli 2 sätt:

• Rho oberoende: mRNA avslutas med långt palindrom s.a. hårnålsögla bildas. Sedan h DNA - lång sträcka A => lång sträcka U mRNA. Hårnålsöglan & d “få” vätebindningar som finns mellan A & U gör försvagad bindning mellan DNA & RNA => mRNA lossnar

• Rho beroende: palindrom i DNA => palindrom i RNA => hårnålsögla. Rho-proteinet binder t mRNA och glider längs d mot transkriptionsbubblan. Rho fungerar s kil och tvingar mRNA att lossna från DNA

Deaminering

En aminosyragrupp tas bort från molekylen

Mutationer: deaminering av cytosin

Spontan reaktion. Cytosins aminogr (NH₂) byts ut mot dubbelbundet syre => cytosin → uracil => felaktig basparning vid replikation/transkription

Mutationer: UV-ljus

UV-ljusets energi orsakar uppbrytning av bindningar mellan kol i kvävebas => bindiningar mellan 2 kvävebaser i samma DNA sträng. Oftast mellan 2 tyminer. Leder till felaktig avläsning v replikation/transkription

Mutationer: kemikalier

Alkylering (-R-CH₃), deaminering, DNA-härmande molekyler som alla leder till felaktig avläsning och därmed basparning v replikation/transkription

E.coli’s reparationssystem

Iom dubbelsträngad, en original en syntetiserad. Den ursprungliga används som mall i reparation

Orginalsträngen: A-nukleotiden i sekvensen GATC är metylerad oavsett var i DNA strängen den är. Nya strängen blir metylerad förrän efter några min

Mismatch repair

Reparerar alla fel utan 1/1000. Proteinet MutS identifierar & binder in t felaktig basparning. MutH binder in vid den närmaste metylerade GATC-sekvensen. MutL binder in och sammankopplar MutS & MutH komplexen. MutHLS bildas och klipper upp den syntetiserade strängen. DNA polymeras kmr m exonukleas aktivitet klippa bort felaktig sträng och syntetitsera ny m rätt nukleotider. DNA ligas limmar ihop

Base exision repair

Sker v vanliga felaktigheter, tex cytosin → urasil. Enzymet Glykosylas känner igen felaktig kvävebas och klipper bort. Socker-fosfat delen klipps bort av annat enzym. DNA-polymeras I sätter dit rätt nukleotid. DNA ligas limmar ihop

Nukleotide excision repair

Lagar DNA sakor från UV-ljus & cigarett rök. Enzymerna UvrA, UvrB & UvrC hittar skadan och klipper bort DNA strängen (12 nukleotider). DNA polymeras syntetiserar ny sträng, DNA-ligas limmar ihop

System för direkt (kemisk) reparation

Ingen bortklippning. Vid solljus kmr enzymet Fotolyas att bryta bindning mellan 2 tyminer & återställa orginalbindningar mha ljusenergi

Gener som alltid transkriberas

Hushållsgener

Varför regleras transkriptionen

För att cellen inte vill spendera energi i onödan

Andra gener regleras genom….

• Promotorn k vara meer/mindre attraktiv. RNA-polymeras binder mer till mer attraktiva (mindre aktiv mindre inbindning)

• Reseptor binder in till operatorn intill promotorn och hundrar därmed RNA-polymeras att binda in. Repressor blir fysisk blokad

• Aktivator binder in v promotorn. Underlättar för RNA-polymeras s.d. lättare k binda in t promotor. Utan aktivator; ingen transkription

Splitsning

Exoner sammanfogas och introner klipps bort

Exoner kan sammanfogas olika sätt = olika mRNA = olika proteiner

5’-huva

Speciella kvävebassekvenser läggs till: speciell nuklotid fästs m 5’-5’-trifostatbindning i RNA 5’-ände

Poly-A-svans

mellan 80-250 adenylatgrupper fästs vid RNA 3’-ände. Förhindrar troligen nedbrytning av DNA

Vad är bakteriers genvariation?

Genvariation hos bakterier uppstår genom mutationer, duplicering av gener och omkombinering.

Vad leder homolog rekombination till?

Homolog rekombination leder till duplicering av gener mellan liknande sekvenser.

Vad är transposoner?

Transposoner är 'hoppande gener' som kan förflytta sig inom genomet.

Vem upptäckte transposoner?

Barbara McClintock upptäckte transposoner och tilldelades Nobelpriset 1983.

Hur sker transformation hos bakterier?

Bakterien tar upp fritt DNA från omgivningen, ofta under stressförhållanden.

Vad är konjugation?

Plasmider överförs via F-pili mellan bakterier, en vanlig metod för spridning av antibiotikaresistens.

Vad är transduktion?

Transduktion är överföring av gener via bakteriofager (virus) som infekterar bakterier.

Vilka tre metoder har prokaryoter för genutbyte?

Prokaryoter har transformation, konjugation och transduktion som metoder för genutbyte.

Vad är skillnaden mellan generell och specialiserad transduktion?

Generell transduktion plockar upp DNA från ett slumpvis valt ställe, medan specialiserad transduktion kräver att DNA:t finns nära fagens integrationsställe.

Vad krävs för att vissa bakterier ska kunna utföra transformation?

Vissa bakterier är naturligt kompetenta eller behöver yttre stress för att öka membranets permeabilitet.

Probiotika

för livet

Antibiotikum med effekt på cellväggssyntes

Penicillin
Verkar endast på växande bakterier och bäst på G+ (tjockare cellvägg). Det blockerar det enzym (PBP) som skapar tvärbindningar mellan lager av peptidoglykan. Sedan kommer människans lysoenzym spjälka bindingarna mellan NAM & NAG → cellväggen lyseras och bakterien dör

Antibiotikum - blockering av proteinsyntas

• Kloramfenikol

• Erythromycin

• Tetracyklin

• Streptomycin

Kloramfenikol

Blockerar proteinsyntas

Binder till ribosomens stora subenhet och blockerar enzymet som flyttar aa från P-plats → A-plats = proteinet translateras inte

Erythromycin

Blockerar proteinsyntas

Binder till ribosomens stora subenhet och blockerar translation

Tetracyklin

Binder till tibosomens lilla subenhet och blockerar inkommande tRNA+aminosyror från att binda till A-platsen

Streptomycin

Binder till ett specifikt proftein i ribosomens lilla subenhet vilket leder till att avläsningen av mRNA blir felaktig

Antibiotikum - effekt på cellmembranet

Polymyxin
Har en hydrofob & en hydrofil ände. Det bindet till gramnegativa bakteriers yttre membran och förstör det vilket leder till att bakterien lyseras

Antibiotikum . effekt på nukleinsyrasyntes

Novobiocin
Stör DNA-gyras (enzym som virar upp DNA-dubbelhelix v replikation). Hela replikationen hämmas

Antibiotikum - kompetitiv inhibition m struktuanaloger

Sulfonamider
Liknar molekylen PABA som bakterien använder fa syntetiserar folsyra (används i sin tur v. replikation)

Kemoterapi

Behandling av infektionssjukdomar elr tumörsjukdomar, inkl elakartade blodsjukdomar, med kemisk framställda läkemedel

Vad är antibiotika?

Läkemedel som används fa behandla bakterieinfektioner. Kan också få infektioner av andra mikroorganismer då fungerar inte antibiotika

När behövs inte antibiotika?

Vid virussjukdomar, ex förkylning, de flesta luftvägsinfektioner, influensa

När behövs antibiotika?

Vid operationer (stor infektionsrisk)
Cellgiftsbehandling, leder till nedsatt
immunförsvar → infektionskänslig
Transplantationer, ges immunnedsättande
behandling fa minska avstötning, leder till
infektionskänslighet
För tidigt födda barn; kan ha helt outvecklat
immunförsvar → infektionskänsliga
Rädda liv vid allvarliga bakteriella sjukdommar;
- Bakteriell lunginflammation
- Bakteriell hjärnhinneinflammation
- Sepsis (blodförgiftning)

Sjukdommar där antibiotika har stor effekt

Sepsis (blodförgiftning)
Allvarlig lunginflammation

Klamydia (ska användas då det annars kan leda till förtilitet)

Sjukdommar där antibiotika har liten/ingen effekt

Förkylning (ingen effekt)
Bihåleinflammation & öroninflammation 1-12 år (Tveksam effekt)

Antibiotikas angripningsområden

• Cellväggssyntes

• Nukleinsyrasyntes

• Proteinsyntesen

• Cellmembranet

• Kompetitiv inhibition m strukturanaloger (s.85 & →)

Inneboende resistens

Bakterien saknar organellerna som antibiotikan angriper vilket gör att det saknar verkan

Resistensmekanismer

• Pumpa ut antibiotikan (mha proteinpumpar, mutationer kan ske och fler av viss pump produceras)

• Minska permeabiliteten i cellmembranet (förändra membranet)

• Förstöra antibiotikan

• Modifiera antibiotikan (producera enzymer s lägger till olika kemiska grupper t antibiotikan → förhindrar binding t målet)

• Kamouflera antibiotikans mål (förändra sammansättning, struktur eller lägga till olika kemiska grupper. Förhindra antibiotikan att interagera m målet)

• Uttrycka nya/alternativa proteiner (gör att antibiotikan inte kan hämma proteinet eftersom de inte finns)

Resistensmekanism - förstör antibiotikan

Vissa bakterieenzym kan inaktivera antibiotika

Exempel, enzymet β-laktamas förstör aktiva komponenten β-laktamringen i penicillin.

Individens påverkan av antibiotikaanvändning

• Dödar patogena bakterier & individen blir frisk

• Kan misslyckas

• Kan påverka normalfloran

Barbara McClintock

transposoner

Paul Ehrlich

Syfilis, systematiska försök

Alexander Flemming

Penicillin

Ilja Metjnikov

Probiotika

Vem, när och hur myntades biotekniken?

Karl Ereky 1919

Han beskrev processer vars produkt framställdes mha mikroorganismer

Ex kunskapsområden

• Molekylärbiologi

• Biokemi

• Genetik

• Cellbiologi

• Nanoteknik

Ex tillämpningar

• Diagnosmetoder

• Husdjursavel

• Genterapi

• Vacciner

• Läkemedel

• Patproduktion

Husmus

Mus musculus, eukaryot; djur. Används till att undersöka däggdjurs funktioner

Zebrafisk

Danio rerio. eukaryot djur. Används för att undersöka fosterutveckling och hur den påverkas av miljögifter och läkemedel

Användning i samhället

• Matproduktion

• Hälsovårdande funktioner

• Hållbar utveckling

Fermentering

Jäsning. Nedbrytning av organiskt material utan sure. Beroende på organismens livsvilkor kand det vara naturlig/onaturligt. Bildar olika produkter, tex etanol, smörsyra & aceton

Vad är morfologiska grupper och vilka är de vanligaste bland bakterier?

Indelningen bygger på utseende hoss bla bakterier.

• Kocker

• Stavar (baciller)

• Spiriller

• Spiroketer

Kocker

Runda

Finns i varianterna Dikock, Streptokock & Stafylokock

Stavar

Även kallade baciller; avlånga och cylindriska

Spirill

Spiralformade, rör sig mha flagell

Spiroketer

Tunnare och mer vridna än spiriller. Rör sig mha roterande cellrörelser

Avikande former - bakterieceller

tex vibrion elr filamentösa

Dikocker

2 kocker bredvid varandra

Streptokocker

Flera kocker på rad

Stafylokocker

Flera kocker i en klump

Vad består en bakterie generellt av?

• Cellmembran

• Nukleinsyrorna (DNA & RNA)

• Cytoplasma

• Ribosomer

Övriga strukturer som kan finnas i en bakteriecell

• Plasmider

• Cellvägg

• Pili

• Endosporer

• Flageller

• Kapsel

• Inklusionskroppar

Nukleinsyran DNA - bakterie

ringformat DNA-dubbelhelix som är fäst vid cellmembranet. Replikeras enbart inför celldelning

Ribosom

Byggs upp av rRNA & proteiner. Består av 2 subenheter (lilla och stora)
- E coli, 30s & 50s = 70 s
- Eukaryota, 40s + 60s = 80s

Ribosomen translaterar mRNA → aminosyrasekvens

Plasmider

Varierar i antal. Ringformad DNA-molekyl, mycket mindre än kromosomen. Innehåller enstaka gener. Replikeras autonomt (utan “skäl”) och inte bara inför celldelning.
Genteknik; kan använda för att infoga utvalda gener. Antibiotiska resistens sitter ofta i plasmider.
Plasmider kan föras över mha F-pili