Espectrofotometria de Absorção no Ultravioleta-Visível

Espectrofotometria de Absorção no Ultravioleta-Visível

• Grande número de biomoléculas absorve luz a comprimentos de onda característicos (ex. triptofano absorve a 280 nm)

• A medida da absorção de luz num espectrofotómetro pode ser usada para detectar e identificar moléculas e para medir a sua concentração em solução.

Lei de Lambert-Beer

descreve a relação entre a fração da luz incidente absorvida pela solução a determinado comprimento de onda está relacionada com a espessura da amostra e com a concentração das espécies em análise

Log (Io/I) = c l

• Io é a intensidade da radiação incidente

• I é a intensidade da radiação transmitida

•  coeficiente de extinção molar (varia com a soluto, solvente, comp. de onda e por vezes com o pH) em condições definidas

• c concentração das espécies em análise

• l espessura da amostra (cuvete)

Absorvência

A relação Log (Io/I)

A= Log (Io/I) logo A =  c l

A é diretamente proporcional à concentração c do soluto na amostra, quando a espessura da amostra (cuvete) é constante (em geral é 1 cm)

Reta de calibração: A=mC + b

Métodos para quantificação espectrofotométrica de proteínas

1. Método Espectrofotométrico Direto

2. Método do Biureto

3. Método de Lowry

4. Método de Bradford

5. Método Bicincrónico (“Bicinchronic”)

Método Espectrofotométrico Directo a 280 nm

Os aa aromáticos (Tyr, Trp, Phe) absorvem na região do UV próximo (280 nm)

É um método rápido, não destrutivo , mas pouco exato

reminder: Trp> Tyr>Phe

Método do Biureto

• É relativamente específico, mas pouco sensível (0,5 a 80 mg/mL)

• Designa-se Método do Biureto por analogia com a reação do produto resultante do aquecimento da ureia com o sulfato de cobre que forma cor violeta.

• Baseia-se no aparecimento de uma cor violeta (max= 540), após reação das proteínas com sulfato de cobre em tartarato, em meio alcalino.

• A cor resulta da formação de um complexo entre o Cu (II) e os átomos de N das ligações peptídicas.

• Esta reação pode dar-se com outros compostos com pelo menos 2 gr. C=O ligados a um átomo de C ou N.

Método de Lowry

• É similar ao método do biureto, mas é mais sensível (1 a 20 g/mL)

• Resulta da combinação entre

• o método do Biureto + Redução com reagente de Folin* (pH 10)

• Forma-se cor azul (max=750nm) que é proporcional à concentração de proteína

• O fosfomolibdotungstato (Reag. de Folin) é reduzido a azul de heteropolimolibdenio por uma reação de oxidação dos aa aromáticos catalisada pelo cobre. A reação forma um cor azul forte que depende em parte do teor de tirosina e triptofano.

Método de Bradford

• É muito sensível: 1 a 20 g/mL (método micro) 20 a 200 g/mL (método macro)

• Baseia-se na reação entre as proteínas com o corante Azul brilhante de Coomassie *

• Após ligação às proteínas o corante muda de cor castanha para azul petróleo

• Forma-se uma cor azul (comprimento de onda max=595nm) que é proporcional à concentração de proteína

Método Bicincrónico (“Bicinchronic”)

• É muito sensível (20 a 2000 g/mL)

• Baseia-se na redução do Cu 2+ a Cu+ pelas proteínas em meio alcalino, usando um método de deteção colorimétrica do Cu+ altamente sensível e seletivo (BCA):

• o método do Biureto + Deteção do cobre por reação com o BCA

• Forma-se uma cor púrpura (comprimento de onda max=562nm) que é proporcional à concentração de proteína

Unidades de massa das Proteínas

1. Massa molecular relativa (Mr)

2. Massa molecular

3. Massa molar

têm o mesmo valor numérico, mas unidades diferentes.

Massa molecular relativa (Mr)

Soma das massas atómicas de todos os átomos da molécula de proteína (relativamente à massa de um átomo de 12 C)

Ex1: A Albumina do soro tem Mr = 66 000

Massa molecular relativa (Mr)

Soma das massas atómicas de todos os átomos de uma molécula de proteína, expressa em daltons (Da) ou kilodaltons (kDa), em que 1 kDa é 1/12 da massa de um átomo de 12 C (1,66  10-24 g ).

Ex2: A Albumina do soro tem MM = 66 kDa ou 66 000 Da

Massa molar (MM)

Massa de uma mole de moléculas de proteína, expressa em gramas

Ex3: A Albumina do soro tem MM = 66 kg mol-1 ou 66 000 gmol-1