9) komunikace mezi buňkami

Proč buňky komunikují?

Pro vnímání okolního a vnitřního prostředí a udržování homeostáze mnohobuněčného organismu.

Jaký je princip buněčné komunikace?

- produkce signální molekuly (ligandu) signalizující buňkou

- předání signálu cílové buňce prostřednictvím receptoru

- aktivace signálních přenašečů uvnitř buňky – přenos k efektorům

- převádění jedné formy signálu na druhou = transdukce signálu

- efektory zajistí buněčnou odpověď

Jaké jsou klíčové hráče v signalizaci?

Signální molekuly (hydrofobní a hydrofilní), receptory (membránové a cytosolické), přenašeče + druzí posli a efektorové proteiny.

efekt signalizace může být

- rychlý (modifikace proteinů)

- pomalý (modifikace genové exprese)

Produkce signálu

využití vezikulárního transportu a exocytózy

Dosah signálů se liší dle

Endokrinní signalizace, Parakrinní signalizace, Signály nervové soustavy,Autokrinní signalizace, Signalizace přímým mezibuněčným kontaktem, Propojení cytosolů buněk

Co je transdukce signálu?

Převádění jedné formy signálu na druhou.

Endokrinní signalizace

- typicky - hormon uvolněný buňkami žlázy

- sekretovaná molekula má dosah v celém těle

- odpovídají jen buňky s příslušným receptorem

- využívá krevního oběhu živočicha nebo mízy rostliny

Co je parakrinní signalizace?

- působení signální molekuly v blízkých/přilehlých buňkách

- transport difuzí extracelulárním prostředím

- např. neurotransmitery mezi neurony a svalovými buňkami

- růstové faktory – tvorba gradientu – rozdílný efekt v závislosti na koncentraci

Jaké signály přenášejí nervové soustavy?

- Působí na velké vzdálenosti (m)

- Směr signálu dán nervovým nebo svalovým vláknem

- Elektrické impulsy (změna membránového potenciálu) se na synapsích mění na parakrinní signalizaci mediátory

Co je autokrinní signalizace?

- odpověď buňky na vlastní signál

- obvykle růstové faktory

- např. buňky in vitro nebo nádorové buňky

Signalizace přímým mezibuněčným kontaktem

- mezi membránovými proteiny dvou buněk

- receptor – ligand

- proteolytické štěpení membránového proteinu -> uvolněné extracelulární části jako solubilního ligandu.

Propojení cytosolů buněk

• - přímá výměna molekul mezi buňkami

  - gap junctions (konexiny) – u živočišných buněk (max. 1kDa)

  - plasmodesmata u rostlinných buněk

Jak se dosahuje reakce buňky na aktivovaný receptor?

Specifickou odpovědí a aktivací nitrobuněčných přenašečů.

ovlivnění efektoru

- genové exprese

- aktivity metabolických enzymů

- konfigurace cytoskeletu

změna chování buněk

- aktivace syntézy DNA

- pohyb

- diferenciace

- smrt

Buňka odpovídá jen na omezený počet signálů

- citlivost je dána přítomností receptorů

- z velkého množství exprimuje každá buňka jen některé

- kombinace signálů – rozdílný efekt

Jaký je účinek acetylcholinu?

- tlumící účinek na b. srdečního svalstva

- stimulace kontrakce b. kosterního svalstva

- stimulace žlázových buněk k sekreci

jak může acetylcholin mít více účinků?

- různé typy receptorů pro stejný signál

- odlišná interpretace stejného signálu různými buňkami (odlišnost přenašečů, efektorů, apod.)

Přenos signálu uvnitř buňky

- signální dráha – kombinace signálních proteinů

- přenos signálu z receptoru k efektoru

- každý stupeň transdukce může amplifikovat signál

- vznik amplifikační kaskády

- rozdělení signálu k různým efektorům

- aktivace/inhibice velkého množství cílového proteinu

Amplifikace signálu

- jedna signální molekula aktivuje jediný receptor

- jediný aktivovaný receptor aktivuje větší počet přenašečů

- každý přenašeč může zajistit odezvu

výsledek amplifikace signálu

nízká koncentrace ligandu – významná odpověď uvnitř buňky – schopnost reakce na malé změny okolí, Např:

- adrenalin (epinefrin) - velmi nízká koncentrace v krvi

- celkem: 10∧8 x zesílení signálu -> produkce glukózy z glykogenu

Signální kaskády využívají přenašeče

- proteiny-přenašeče přepínají mezi polohami „zapnuto“ a “vypnuto“

- podstata přepnutí: obvykle připojení nebo odpojení zbytku kyseliny fosforečné nebo GTP/GDP

- signál převádí stav přenašeče z neaktivního do aktivního stavu

Co určuje odpověď buňky na signály?

Přítomnost receptorů a jejich kombinace signálů.

Jaké jsou molekulové přepínače?

Fosforylace a vazba GTP.

fosforylace jako molekulový přepínač

- proteinkináza, katalyzuje kovalentní připojení fosfátu k proteinu

- proteinfosfatáza, katalyzuje odstranění fosfátu

- regulační kináza/fosfatáza je často sama podrobena kontrole fosforylací jinou kinázou: vznikají fosforylační kaskády

vazba GTP jako molekulový přepínač

- týká se G-proteinů

- vazba GTP (guanozintrifosfátu) – zapnuto – přímou interakcí s receptorem nebo proteiny GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor)

- vazba GDP (guanozindifosfátu) – vypnuto pomocí proteinů GAP (GTPase-Activating Protein)

- přepnutí reflektuje stav receptoru

co jsou to G-proteiny

G-proteiny jsou signální proteiny, které se vážou na GTP a GDP a fungují jako molekulové přepínače v buněčné komunikaci. Aktivují se vazbou GTP a inaktivují se vazbou GDP, což ovlivňuje různé buněčné procesy.

Průchodnost membrány pro ligandy

- rozhoduje velikost a chemická povaha signální molekuly

- velké a hydrofilní molekuly nemohou membránou projít - aktivují povrchové receptory

- malá a hydrofobní molekuly difundují membránou a vážou se na nitrobuněčné receptory

Steroidní a thyroidní hormony, retinoidy a vitamín D

- hydrofobní a nízkomolekulární

- procházejí membránou

- vážou se na receptory v cytosolu nebo jádře

- jejich receptory fungují jako regulátory genové exprese závislé na ligandech

- vazba ligandu - změna konformace receptoru - změna schopnosti vazby DNA nebo aktivace exprese cílových genů

Oxid dusnatý (NO)

- prochází plazmatickou membránou a přímo aktivuje cílové enzymy

- nemění genovou expresi – rychlejší odezva

- snadno difunduje z buněk produkčních do buněk cílových

- působí lokálně a existuje jen krátkodobě (reakcí s vodou a kyslíkem se mění na dusičnany a dusitany)

- v buňkách obvykle aktivuje guanylátcyklázu, která katalyzuje tvorbu cyklického GMP

Co dělá cyklický GMP (cGMP)?

Aktivuje různé efektory a podílí se na vasodilataci.

jak vzniká v organismu NO

- vzniká z argininu, např. u endoteliálních buněk, které vystýlají cévy

- nervové buňky vyšlou signál - endoteliální buňky produkují NO, který uvolní buňky hladkého svalstva cévních stěn – céva se roztáhne – krev v ní může lépe proudit

Nitroglycerin

- nitroglycerin se v těle mění na NO

- využití v medicíně: při infarktu nebo angině pectoris

- uvolňuje krevní cévy a snižuje zátěž srdce

Hlavní typy povrchových receptorů

receptory spřažené s iontovými kanály (ion-channel-coupled receptors), receptory spřažené s G-proteinem (G-protein-coupled receptors), receptory spřažené s enzymy (enzyme-coupled receptors)

Co dělá receptory spojené s iontovými kanály?

- bez enzymové aktivity

- vazbou ligandu ovlivňují průchodnost membránových kanálků

- změna permeability - změna toku iontů

jak fungují receptory spřažené s G-proteinem (G-protein-coupled receptors)

- bez enzymové aktivity

- řídí aktivitu enzymů nebo průchodnost kanálků prostřednictvím membránového proteinu G („GTP-binding regulatory protein“)

Signální ligandy

- často ovlivňují fyziologii a pocity organismu

- molekuly exogenní látek (léky, tišící prostředky, drogy, …) často napodobují přirozený ligand a se vážou na receptor a blokují (antagonisté) nebo nadměrně stimulují (agonisté) jeho aktivitu

Jak fungují receptory spojené s enzymy?

vazbou ligandu získávají katalytickou schopnost, obvykle transmembránové proteiny s proteinkinázovou aktivitou

Jak jsou chemické signály převáděny na elektrické?

- zajišťují receptory spřažené s iontovými kanálky

- synapse v nervosvalovém systému

- chemický signál (nervový mediátor) se převádí na elektrický signál v podobě změny permeability plazmatické membrány cílové buňky

Jaký proces se používá k amplifikaci signálu?

Každý stupeň transdukce signálu může signál amplifikovat.

charakteristika receptorů spřažených s G-proteinem

- početná rodina, stovky členů

- zprostředkovávají odpovědi na rozmanité podněty (např. hormony, lokální mediátory, nervové mediátory)

nitrobuněčná doména pro vazbu G-proteinu

striktura receptorů spřažených s G-proteinem

charakteristická struktura: jediný polypeptidový řetězec procházející dvojvrstvou membrány 7x

evoluční konzervativnost: receptorů spřažených s G-proteinem

u obratlovců (fotoreceptorový protein sítnice rhodopsin, čichové receptory), u kvasinek, atd.

Struktura velkých G-proteinů

- několik variant, každá je specifická pro určitý okruh receptorů a následných přenašečů signálu

- hlavní struktura je obdobná u všech:

- 3 proteinové podjednotky: α, β, γ

- klidový stav: všechny podjednotky pohromadě, k α-podjednotce navázán GDP

Spojení receptorů s G-proteiny

- G-protein je umístěn na cytosolové straně membrány

- vazba ligandu konformační změna receptoru – interakce s G-proteinem

- aktivace G-proteinu (vazba GTP místo GDP)

Struktura aktivovaných G-proteinů

- po stimulaci receptoru ligandem: interakce receptoru s G-proteinem

- záměna GDP za GTP na podjednotce α

- Rozdělení G-proteinu na podjednotku α s navázaným GTP a na komplex podjednotek βγ

- obě části mohou samostatně difundovat membránou, interagovat s cílovými molekulami a předávat jim signál

Aktivita G-proteinů je dočasná

podjednotka α má vnitřní GTPázovou aktivitu, která po určité době (několika sekund) hydrolyzuje GTP na GDP

- podjednotka α pak obnoví spojení s podjednotkami βγ

- signalizace je vypnuta

Vliv G-proteinů na iontové kanály

- např. regulace činnosti srdce:

- nervová vlákna uvolňují acetylcholin, který se váže na receptor v buňkách srdečního svalu

- aktivace G-proteinu

- komplex podjednotek βγ se váže ke kanálku pro K+ v membráně buněk srdečního svalu a otevře jej

- změna elektrických vlastností svalové buňky – omezení frekvence stahů/relaxace

Vliv G-proteinů na membránové enzymy

komplexnější důsledky – tvorba dalších nitrobuněčných signálů

nejčastější cílové enzymy G-proteinů

- adenylátcykláza (tvorba cAMP)

- fosfolipáza C (tvorba inositoltrifosfátu a diacylglycerolu)

- V obou případech je aktivace receptoru spřažena s tvorbou malých signálních molekul, které rychle a ve velkém počtu vznikají a snadno difundují cytosolem k efektorům

Jakou roli hrají G-proteiny v signální dráze?

Přenášejí signál z receptoru na efektory.

Hladina cAMP

- nducibilní adenylátcykláza katalyzuje tvorbu cAMP z ATP

- cAMP-fosfodiesteráza je konstitutivní - štěpí cAMP na AMP

- hladina cAMP může během sekund vzrůst nebo poklesnout 10x

- adenylátcykláza je pod kontrolou G-proteinu

- účinek může být stimulační nebo inhibiční – dáno typem G-proteinu

Co je hlavní funkcí kalmodulinu?

Regulace enzymatické aktivity citlivých na Ca2+.

Jaké enzymy aktivují G-proteiny?

Adenylátcykláza a fosfolipáza C.

Význam cAMP

- cAMP je rozpustný ve vodě, snadno difunduje buňkou

- aktivuje efektory: např. cAMP-dependentní proteinkinázu A

- kináza A fosforyluje různé substráty a mění tak jejich aktivitu (např. regulátory genové exprese)

cAMP se účastní stresové signalizace

- stres: v nadledvinách se uvolní adrenalin a přejde do krve

- váže se na receptory spřažené s G-proteinem (adrenergní receptory) různých buněk

- v kosterním svalstvu: stimulace adenylátcyklázy – navýšení cAMP

- cAMP aktivuje kinázu A, která fosforyluje enzymy metabolismu glykogenu

- aktivuje se mechanismus odbourávání glykogenu na glukózu

- zajištění dostatečného množství glukózy pro očekávanou svalovou námahu

- signalizace nevede ke změně genové exprese – je relativně rychlá

Jaké jsou rychlé odpovědi na cAMP?

Modifikace enzymů, například odbourávání glykogenu.

Jaké jsou pomalé odpovědi na cAMP?

- odezva během minut až hodin

- cAMP aktivuje kinázu A

- kináza A fosforyluje proteiny řídící transkripci určitých genů

- nově exprimované geny zajistí změnu chování buňky

G proteiny mohou aktivovat fosfolipázu C

- fosfolipáza C působí na membránový inositolový fosfolipid: odštěpí hydrofilní hlavičku: vzniká cukerný inositoltrifosfát (IP3) a lipidový diacylglycerol (DAG)

- IP3 difunduje cytosolem k ER: otevře kanály v membráně ER, kterými proudí Ca2+ do cytosolu

- Ca2+ stejně jako diacylglycerol aktivuje proteinkinázu C

- kináza C fosforyluje své substráty

Rozložení iontů Ca2+ není rovnoměrné

- Koncentrace Ca2+ v cytosolu je výrazně nižší než v mimobuněčném prostoru a endoplazmatickém retikulu

- gradient je udržován membránovými pumpami

- když signál přechodně otevře kanálky, ionty Ca2+ rychle proudí do cytosolu a aktivují zde proteiny, které jsou na Ca2+ citlivé

- mezi hlavní proteiny citlivé na Ca2+ patří kalmodulin

Kalmodulin

- univerzálně rozšířen

- po navázání 4 iontů Ca2+ mění konformaci

- nový tvar umožňuje vazbu k mnoha proteinům, čímž se mění jejich aktivita

- hlavní cílem kalmodulinu jsou CaM kinázy (Ca2+/calmodulin dependent kinases) – fosforylují transkripční faktory

Receptory spojené s enzymy charakteristika

- často zajišťují odpovědi buněk na růstové faktory

- ligandem aktivované receptory získávají katalytickou schopnost

- abnormální signalizace z těchto receptorů často souvisí s poruchami proliferace, diferenciace, životaschopnosti, migrace buněk (nádorová transformace)

Receptory spojené s enzymy - struktura

- jeden transmembránový úsek

- doména vázající ligandy směřuje ven z buňky

- cytoplazmatická doména má enzymovou aktivitu buď sama o sobě a nebo tvoří s enzymem komplex

- enzymová aktivita má proteinkinázovou povahu

Receptorové kinázy - aktivace

- vazba ligandu

- ligand-dependentní dimerizace receptorů

- kontakt sousedních receptorů aktivuje jejich kinázovou aktivitu – dojde k vzájemné fosforylaci

- fosforylované tyroziny spolu se sousedními aminokyselinami slouží jako místo vazby nitrobuněčných signálních proteinů

Receptorové kinázy: aktivace Ras

- aktivované receptory prostřednictvím adaptérů aktivují tzv. malé (jednopodjednotkové) G-proteiny (Ras)

- odtud se signál šíří dále do nitra buňky

Protein Ras

- ukotven na cytoplazmatické straně plazmatické membrány

- člen rodiny malých G-proteinů s jedinou podjednotkou

- funguje jako molekulový přepínač se dvěma konformačními stavy: aktivním s navázaným GTP a neaktivním s navázaným GDP

- aktivuje kinázovou signální kaskádu zajišťující změnu genové exprese, která buňku přivádí k aktivní proliferaci

- poruchy Ras (hyperaktivace) jsou běžné při tvorbě nádorů

- dědičné poruchy = Rasopatie

Fosforylační kaskáda aktivovaná Ras

- postupná fosforylace/aktivace sledu proteinkináz MAP

- signál postupuje od membrány k jádru, zesiluje se a rozděluje do různých směrů

Jaký je důsledek aktivace Ras?

Změna genové exprese a buněčné proliferace.

cílové efektory: Ras

- proteiny, které změní aktivitu

- transkripční faktory, které změní spektrum exprimovaných genů

výsledek fosforylační kaskáda aktivovaná Ras

výsledkem je změna chování buněk obvykle v úrovni jejich proliferace nebo diferenciace

Ras je klíčový regulátor proliferace

- např. intracelulární injekce protilátek anti-Ras: ztráta schopnosti receptoru aktivovat buněčnou odpověď na příslušný růstový faktor

- mutace zvyšující aktivitu Ras: buňka reaguje stejně, jakoby byla neustále stimulována růstovým faktorem

- mutace v genech ras identifikovány v cca 30 % případů rakoviny

Co se děje při hyperaktivaci Ras?

Dovede k neadekvátní proliferaci buněk, často při rakovině.

Jaké proteiny jsou cílem G-proteinů?

Iontové kanály a membránové enzymy zodpovědné za tvorbu sekundárních přenašečů

Jaké jsou důsledky abnormální signalizace z receptorů spojených s enzymy?

Poruchy proliferace a diferenciace buněk.

Co dělá kináza A aktivovaná cAMP?

Fosforyluje různé substráty a mění jejich aktivitu.

Kde se nachází vazebná místa G-proteinů?

Na cytosolové straně membrány.

Jak se přepínají receptory na membráně?

Dimerizací a vzájemnou fosforylací.

Jak fungují receptory spojené s enzymy?

Získávají katalytickou schopnost vazbou ligandu.

Jak se mění genová exprese v buňce?

Následkem aktivace kinázové signální kaskády.

Integrace signálů v buňkách

- signální dráhy spolu interagují

- výměna informací mezi drahami

- integračními prvky jsou především kinázy, které fosforylují složky alternativních drah

Mechanismy integrace signálu

- spojení informací z různých zdrojů je podmínkou řádného vyhodnocení situace a zajištění správné odpovědi

- některé proteiny slouží jako spojnice toku informací různých drah

- např. mají několik míst, která mohou být fosforylována různými kinázami

- nebo aktivní protein vzniká z podjednotek pouze tehdy, jsou-li obě fosforylovány.

Co je princip SH2 domény?

Vazba k fosforylovaným tyrozinem, nezbytná pro signální kaskády.