1. Clonage d'un gène codant de procaryote dans un vecteur plamsique

Qu’est ce qu’un gène codant ?

C’est un gène qui va coder pour une protéine avec un ensemble de séquences sur l’ADN qui comporte des séquences régulatrices et des séquences fonctionnelles

Quelles sont les deux étapes enzymatiques importantes pour obtenir une protéine ?

* la transcription (ADN → ARN)
* la traduction (ARN → Protéine)

Par quelle enzyme est réalisée la transcription ?

L’ARN polymérase

Par quelle enzyme est réalisée la traduction ?

Le ribosome

Qu’est ce que la transcription ?

Le passage de l’information de l’ADN à l’ARN messager

Qu’est ce que la traduction ?

Le passage des acides nucléiques à des acides aminés

Quels sont les éléments nécessaires (sur l’ADN) à la transcription d’une partie codante ?

* un promoteur
* une séquence de tête (conservé en ARN)
* la partie codante (conservé en ARN)
* séquence de pause (conservé en ARN)
* un terminateur

Quels éléments vont être reconnus par l’ARN polymérase ?

le promoteur et le terminateur

Quels éléments vont être reconnus par le ribosome ?

La séquence de tête et la séquence de pause

Est-ce que le code utilisé pour les protéines est universel ?

Oui il est partagé entre tous les organismes vivants (virus, bactérie, plante, animal)

Qu’est ce qu’un procaryote ?

C’est un organisme unicellulaire qui ne possède pas de vrai noyau ni d’organites. Son ADN n’est pas contenu dans une structure avec une membrane

Qu’est ce qu’un plasmide ?

C’est une structure d’ADN circulant circulaire double brins avec réplication autonome du chromosome, présente seulement chez les procaryotes (sauf levures)

Utilité d’utiliser un plasmide plutôt que le chromosome ?

Il est plus petit donc plus facile à purifier et à manipuler sans l’abimer + il se réplique de manière autonome : donc on peut le réinjecter dans d’autres organismes compatibles.

Qu’est ce que ORI sur le plasmide ?

C’est l’origine de réplication

Qu’est ce qu’une enzyme de restriction

c’est une endonucléase qui va venir couper spécifiquement l’adn

Qu’est-ce que le site de restriction sur un plasmide (MCS) ?

Site avec plusieurs séquences d’ADN reconnues par des enzymes de restrictions (enzymes qui vont venir couper l’ADN)

Quel est l’utilité d’avoir des marqueurs de sélections quand on fait une recombinaison ?

Parce que rien de ce que l’on fait ne marche à 100% donc il n’y aura que quelques cellules qui exprimeront notre plasmide recombiné.

Donner un exemple de marqueur de sélection possible pour identifier les cellules portant notre plasmide recombiné ?

ajouter un marqueur de résistance à un antibiotique dans notre plasmide comme ça les cellules résistantes seront celles avec le plasmide recombiné

si un site de restriction se trouve dans un gène de résistance antibiotique existant sur le plasmide, qu’est ce qu’il se passe si on rajoute un ADN recombinant au niveau du site de restriction ? (+ donner le nom de ce type de selection)

le gène initial de résistance antibiotique se retrouve séparé en deux par l’ADN recombinant ajouter, le gène devient donc non fonctionnel ( Double sélection avec antibiotique)

Expliquer le système de selection “Blanc/Bleu”

sur certains plasmides le site de restriction interrompt l’enzyme LacZ qui est capable de cliver le Xgal ce qui produit une coloration bleue. Donc si l’ajout de l’ADN recombinant à marché, il n’y aura pas de coloration bleue

Donner les étapes du clonage en gros

* Sélection de notre gène précis
* PCR pour isoler le gène
* association gène-vecteur à l’aide d’enzymes de restrictions (vont permettre de faire des bouts collant compatibles)
* réintroduction du vecteur recombiné dans nos bactéries avec des enzymes assurant la ligature puis un choc de température ou électrique pour passer la membrane bactérienne