Klinsch Chemische Labordiagnostik

Ziel der Lehrveranstaltung Tag 1

Bestimmung der unbekannten Massenkonzentration zweier Kaliumpermanganat-Lösungen (KMnO4) mittels grafischer Kalibrierung und der Transmission als Messsignal

messen

vergleichen

Kalibrierung

Standard

Wellen-Teilchen-Dualismus

Licht kann sowohl als Welle als auch als Teilchen, Photonen, betrachtet werden

Bereich des sichtbaren Lichts

400 nm bis 800 nm

> 800 nm

Infrarot-Bereich

< 400 nm

UV-Bereich

verschiedenen Wechselwirkungen zwischen Licht und Materie

Absorption, Reflexion, Emission, Transmission und Brechung

Absorption

strahlt man Licht durch ein gefärbtes Medium, wird ein Teil des Lichtes von den Molekülen aufgenommen

Transmission

strahlt man Licht durch ein gefärbtes Medium, so wird ein Teil durchgelassen

polychromatisches Licht

“viel-farbig”, Licht aus einer Mischung unterschiedlicher Farben, spektralbreitbandig

monochromatisches Licht

“eine Farbe”, einfarbiges sichtbares Licht, elektromagnetische Strahlung einer genau definierten Frequenz

Transmission T

Quotient von ϕ₁/ϕ₀, Quotient von ausgestrahltes Licht/ eingestrahltes Licht, T% = ϕ₁/ϕ₀ × 100

Schematischer Aufbau eines Photometers

Lichtquelle → Linse(n) → Blende(n) → Filter - ϕ₀ → Küvette - ϕ₁ → Strahlungsdetektor → Anzeige

KMnO₄

Kaliumpermanganat

KMnO₄ Versuch

Mit einer KMnO₄-Verdünnungsreihe werden unbekannte Konzentrationen der KMnO₄-Lösungen bestimmbar, Messignale (T%) auf der y-Achse , auf der x-Achse bekannte Konzentrationen (mmol/L) eingetragen am Millimeterpapier

Extinktion

E = −logT = log 1/T = log ϕ₀/ϕ₁

Extinktion E

Extinktion bei einer bestimmten Wellenlänge ist der negative dekadische Logarithmus der Transmission T

Proportionalität

Transmission: exponentiell, indirekt proportional
Extinktion: direkt proportional

Pierre Bouguers

Schichten, gleicher Art und gleicher Dichte, bestimmten proportionalen Anteil des einfallendes Lichts absorbieren

Lambert Experiment

Strahlungsleistung oder Lichtstrom des austretenden Lichtes nimmt exponentiell ab bei linearer Zunahme der Schichten (Schichtdicke)

Lambert Experiment Strahlungsleistung

ϕ₀ 100% → -50% ϕ₁= 0,5 → -50% ϕ₂= 0,25 → -50% ϕ₃=0,125

allgemein nach Lambert

ϕ= (1/x)^d * ϕ₀ → austretendes Licht

Beers Experiment

Beer ließ die Schichtdicke d konstant und veränderte die Konzentration c

allgemein nach Beer

ϕ= (1/y)^c * ϕ₀

Lambert und Beers allgemeine Formulierung

ϕ= (1/ x*y) ^c*d * ϕ₀

Lambert-Beer’sche Gesetz

E= ϵ * c * d

Paracetamol

Para(acetylamino)phenol

spezifisch molare Extinktionskoeffizient ϵ

ϵ= E/c*d

spezifisch molare Extinktionskoeffizient ϵ Einheit

L/mol*cm

Stoffmenge n Formel

n=m/M
m= Masse

M=molare Masse

Proteine

biologische Makromoleküle, die aus Aminosäuren aufgebaut sind, befinden sich in alles Zellen

Aminosäuresequenz

Aminosäuresequenz eines Proteins → sein Aufbau ist in der DNA codiert

Hauptfunktionen der Proteine

• Aufbau

• Schutz

• Transport

• Signalfunktion

• regulatorische Funktionen

• Reservestoffe

Gesamtheit aller Proteine

Proteom

Aminosäuren

kleinste Proteinbausteine, organische Verbindung mit mind. einer Carboxygruppe (-COOH) und Aminogruppe (-NH₂), 20 sind proteinogen, 8 AS sind essentiell

proteinogen

Protein bildend

chiral

alles AS sind chiral aufgebaut, ausgenommen Glycin

Peptid

miteinander verknüpfte Aminosäuren

Peptidbindungen

zwischen der Säuregruppe der einen und der Aminogruppe der anderen Aminosäure (jeweils am α-C-Atom)

räumlicher Aufbau

• Primärstruktur - Aminosäuresequenz

• Sekundärstruktur - Substrukturen

• Teritärstruktur - 3d Strukturen

• QuartärsturkturKomplex aus Proteinmolekülen

Totalprotein

TP, gesamte Eiweißgehalt der Blutflüssigkeit gemessen

Referenzbereich Biuret Methode

66 - 83 g/L

Dysproteinämie

Verschiebung des Eiweißgehalts

Hypoproteinämie

zu wenig Eiweiß, Mangel, < 66 g/L

Hyperproteinämie

zu viel Eiweiß, > 83 g/L

Indikation von Total Protein

• Inflammation

• Proteinurie

• Ödeme

• chronische Nierenerkrankung

• chronische Lebererkrankung

• maligner Tumor

• Verbrennungen

Primärstandard

durch Einwaage einer definierten Menge in ein Lösungsmittel gewonnen, Substanzen höchster Reinheit, bei selbst hergestellten Standards auf Reinheit der Substanzen zu achten

Sekundärstandard

entspricht weitgehend der Matrix der Probe, enthält gleiche Komponenten wie Untersuchungsmaterial, Konzentrationsermittlung der Kalibratoren erfolgt durch chemische Analyse unter Bezugnahme auf primäre Standards mit Analysenmethoden bekannter Präzision

1-Punkt Kalibrierung

wird mit nur einem Kalibrator durchgeführt, wobei die Kalibriergerade durch den 0-Punkt, der durch den Reagenzienleerwert festgelegt wird, geht

β-D-Glucose

Bestimmung der unbekannten Glucosekonzentration einer Probe mittels der enzymatischen Endpunktmethode GOD-PAP über eine 2-Punkt Kalibrierung

Aufgabe von Kohlenhydraten

• Energiespeicher

• Brennstoff

• ATP

• Strukturelement in Zellwänden von Pflanzen und Bakterien

• Schlüsselrolle in Zell-Zell—Erkennungsprozessen

• Zellen sind auf Glucose zur Aufrechterhaltung ihrer Funktionen angewiesen: Muskelzellen, Nervensystemzellen, Erythrozyten

Referenzbereich GOD-PAP Methode

Erwachsene, nüchtern: 60 - 99 mg/dL

Hypoglykämie

zu wenig Glucose, < 60 mg/dL

Hyperglykämie

zu viel Glucose, > 99 mg/dL

gemessene Extinktion setzt sich zusammen aus

E_gemessen = E_Probe + E_{Probenleerwert} + E_{Reagenzienleerwert}

Kalibrierfunktion

Die Kalibrierfunktion ist der funktionale Zusammenhang zwischen dem Erwartungswert eines Messsignals (z.B. Extinktion) und der Messgröße (z.B. Massenkonzentration)

Analysenfunktion

Wird die Kalibrierfunktion nach der gesuchten Konzentration umgestellt, nennt man das Ergebnis Analysenfunktion

2-Punkt Kalibrierung

wenn Merkmals- und Signalgröße voneinander linear abhängig sind, reichen 2 Punkte für gesamten Zusammenhang zu beschreiben. Kalibriergerade geht nicht zwingend durch den 0-Punkt. Steigung sit der Quotient aus den Differenzen der beiden Messignalen und Messgrößen der Datenpunkte gebildet

s-Grenzen

µ ± 1 σ → 68,27%
µ ± 2 σ → 95,45%
µ ± 3 σ → 99,73%

γ-GT

γ-Glutamyltransferase

Was sind Enzyme?

Katalysatoren biologischer Systeme, bestimmen Muster chemischer Umsetzungen bzw. auch Umwandlung von einer Energieform in die andere

Enzyme

• beschleunigen Reaktionen um 10⁸ bis 10²⁰

• gehen unverändert aus Reaktion hervor

• Stoffklasse der Proteine

• katalysieren alle Stoffwechselabläufe im Organismus

Substratspezifität

Fähigkeit eines Enzyms an bestimmte Substrate zu binden und nur spezifische Reaktionen zu katalysieren

Wirkungsspezifität

von den vielen möglichen Reaktionen, die ein Stoffwechselzwischenprodukt eingehen kann, wird nur eine einzige Reaktion katalysiert

Zellenzyme

zellgebundene Enzyme des Energiestoffwechsels, Enzyme mit spezialisierten Funktionen, Wirkungsort liegt innerhalb der Zelle → Zytoplasma, Mitochondrien, Zellkern, Membran; bei vielen Organkrankheiten ist der Enzymaustritt gesteigert

Sekretenzyme

in exokrinen Drüsen gebildet (Pankreas, Parotis, Prostata), gelangen durch Sekretion an Wirkungsort, Schädigung der Herkunftsorgane vermehrt im Blut, weitgehend organspezifisch

Plasmaspezifische Enzyme

entfalten Aktivität im Plasma, bei Krankheit ist eine erniedrigte Enzymaktivität im Blut, z.B. Cholinesterase und einige Gerinnungsfaktoren

1 Internationale Enzymeinheit

1 U, diejenige Enzymaktivität, die unter Standardbedingungen die Umsetzung von 1 µmol Substrat pro Minute katalysiert

Reaktionsbedingungen

• Temperatur

• pH-Wert

• Konzentration und Art des Substrates

• Konzentration und Art des Co-Substrates

• Pufferkonzentration

• Ionenstärke

Peptidase

katalysier den Transfer von Aminosäuren von einem Peptid zum anderen

Glycylglycin

Referenzbereich Szasz/Persijin standardisiert nach IFCC

Frauen < 40 U/L
Männer < 60 U/L

Differenzen zwischen Messpunkten

E₁= E₁ - E₀

Massenkonzentration

U/L _Probe = (U/L _{Kalibrierlösung} / ØΔE_{Kalibrierlösung} ) * ØΔE_Probe

LDH

Laktatdehydrogenase

Peptidbindung

Glyceral

Glycerin

Glyceron

D-Glyceral

L-Glyceral

D-Glucose

L-Glucose

Oxidation

e^- - Abgabe
H⁺-Abgabe

Reduktion

e^- - Aufnahme
H⁺- Aufnahme

Lactat

Pyruvat

NAD⁺

NADH

einfacher optischer Test nach Warburg mit Probenstart

Lactat oxidiert zu Pyruvat
NAD+ wird reduziert zu NADH

Bei welcher Wellenlänge wird bei LDH gemessen und warum?

bei 340 nm, weil dort der Extinktionsunterschied am größten ist

Enzymkinetik

beschreibt die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion und soll Auskunft darüber geben, wie effektiv das Enzym diese Reaktion katalysiert

Biuret-Methode

Zweiwertige Kupferionen reagieren im alkalischen Milieu mit je vier Peptidbindungen der Eiweiße zu einem charakteristischen violetten Biuretkomplex. Mittels Kaliumnatriumtartrat wird die Ausfällung von Kupferhydroxid und mit Kaliumjodid die Autoreduktion des Kupfers verhindert.

zwei Möglichkeiten Enzymaktivität nachzuweisen

• durch Abnahme der Konzentration des Substrats, das mit Hilfe des Enzyms in ein Produkt umgewandelt wird

• durch Zunahme der Konzentration des Produkts, das im Laufe der Enzymreaktion gebildet wird

steady state

Zustand bei dem Konzentration über einen bestimmten Zeitraum relativ konstant bleibt, weil die Rate der Zufuhr bzw. Bildung der Rate des Abbaus bzw. Ausscheidung entspricht.

Michaelis-Menten Gleichung

beschreibt Abhängigkeit der Umsatzgeschwindigkeit des Enzyms von der Substratkonzentration und kann Geschwindigkeit einer ablaufenden Reaktion vorhersagen

AL(A)T

Alanin-Aminotransferase

Indikation AL(A)T

Kenngröße einer Leberzellschädigung,
Erkennung von Leberschäden durch:

• Alkohol

• Arznei

• Hepatotoxine

• Überernährung

autoimmune Lebererkrankung

Verdacht auf hereditäre Stoffwechselstörung

IFCC Methode zur Bestimmung ALAT-Aktivität

Die Alanin-Aminotransferase katalysiert die Übertragung einer Aminogruppe von Alanin auf 2-Oxoglutarat unter der Bildung von Glutamat und Pyruvat