Tema 10: Métodos de esterilización

Esterilización

Proceso por el que se elimina TODO tipo de actividad biológica de un material → TÉRMINO ABSOLUTO

Desinfección

Proceso para eliminar o reducir la carga microbiana de materiales inertes, haciéndolos seguros para su uso (OJO¡¡ no asegura la eliminación de endosporas bacterianas)

Antisepsia

Proceso de desinfección sobre superficies corporales, utilizando para ello agentes antisépticos → agentes desinfectantes de baja toxicidad

Tipos de sustancias empleadas para la desinfección

• Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos.

• Microbicidas (germicidas): sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las esporas de un microorganismo.

• Microbiostáticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos. Pero lo que está está, no lo matan.

• Desinfectantes: sustancias antimicrobianas empleadas sobre objetos inanimados. Ej: Lejía.

• Antisépticos: sustancias antimicrobianas que se aplican sobre superficies corporales. Exhiben baja toxicidad. Ej: Betadine.

Cinética de muerte microbiana

Una población microbiana NO muere instantáneamente cuando se expone a un agente letal. Suele ser en una función exponencial.

Condiciones que la afectan:

1. Número inicial de individuos en la población.

2. Estado fisiológico de los microorganismos (ojo ¡¡ → presencia endosporas bacterianas).

3. Tipo de microorganismo.

4. Entorno ambiental en el que se desarrolla.

5. Dosis del agente y el tiempo de exposición.

Métodos de esterilización

• Agentes físicos

  • Energéticos: el calor (húmedo y seco) y las radiaciones.

  • Mecánicos: la filtración.

• Agentes químico:

  • Aldehídos: Formaldehído y Glutaraldehído.

  • Óxido de etileno.

  • Plasma-gas de peróxido de hidrógeno.

Parámetros utilizados en los tratamientos por calor

IMPORTANTE: dependiendo de la temperatura y el tiempo a que sometamos un material, lograremos inactivación parcial o bien inactivación total (esterilización).

Parámetros usados en la industria alimentaria:

• Punto térmico mortal (PMT).

• Tiempo de muerte térmica (TMT).

• Tiempo de reducción decimal (D). (T necesario que hay que aplicar a una población microbiana para reducir 10 veces su población a una determinada T).

Calor húmedo

Más efectivo que el calor seco porque requiere menos tiempo y Tº. Esto se debe a:

• Agua es una especie química muy reactiva y desplaza a los puentes de hidrógeno.

• El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

Los métodos usados son:

• Ebullición (no esteriliza→endosporas)

• Autoclavado

• Pasteurización

• Uperización

• Tindalización

Autoclavado

Aparato que esteriliza el material exponiéndolo a vapor de agua, a temperatura superior a la de ebullición del agua, bajo presión.

Pasteurización

Asegura la eliminación de microorganismos patógenos de la leche, así como la reducción/eliminación de muchas bacterias no patógenas pero causantes de la modificación del alimento. No es un método de esterilización ya que no acaba con las endosporas.

2 tipos:

• LTH (low temperature hold) : 63-66ºC durante 30‘.

• HTST (high temperature short time) : 72ºC durante 15“ → Posterior enfriamiento a 10ºC.

Uperización (UHT)

Proceso de esterilización usando temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (135-150ºC durante 1-2 segundos). Muy utilizado en industrias lácteas y de otros alimentos que tras el proceso NO requieren almacenamiento en frío.

Tindalización

Proceso de esterilización por calentamiento discontinuo a Tª de 100ºC como máximo.

Proceso: calentamiento y posterior incubación. El proceso se repite durante tres días consecutivos.

Fundamento teórico: Se procede a la destrucción de las formas vegetativas durante los períodos de calentamiento, permitiendo que las esporas germinen durante el periodo de incubación dando lugar a formas vegetativas, susceptibles de ser eliminadas en el siguiente calentamiento.

Calor seco

Es la forma más generalizada y sencilla de esterilización y control del crecimiento microbiano.

El calor provoca:

1. Desnaturalización de proteínas.

2. Fusión y desorganización de las membranas y/o.

3. Procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos: → efecto letal (lisis térmica).

Pero es menos efectivo que el calor húmedo.

Las endosporas resultan muy resistentes (x presencia de dipicolinato cálcico).

Métodos:

• Horno Pasteur.

• Incineración.

• Flameado (prácticas de laboratorio).

Horno Pasteur

Recinto metálico de doble pared con aislante entre ambas y una puerta. La fuente de calor suele ser eléctrica y está incorporada.

Posee un ventilador que facilita la circulación del aire caliente, para homogeneizar la temperatura.

Un termómetro visible desde fuera, registra la temperatura del interior del recinto.

Condiciones de esterilización: 160º-170ºC durante 2-3 horas.

Objetos: material de vidrio, instrumentos quirúrgicos y objetos metálicos. (Porque no habrá vapor de agua).

Radiaciones

Se basan en la emisión y propagación de energía, en forma de onda electromagnética (Rx, Rγ ...), o bien en forma de partícula (α, β, n, p, ...).

Las radiaciones tienen una doble naturaleza → ondulatoria y corpuscular

Diferencia entre radiaciones ionizantes y no ionizantes

• Ionizantes: (E mayor a 10 eV) La radiación incidente tiene energía suficiente para arrancar electrones de su orbital provocando: inactivación, rotura, cadena de ionizaciones. Ej: Parte de UV, Rayos X y Gamma.

• No ionizantes: (E inferior a 10 eV) Los electrones aumentan su nivel de energía pero sólo temporalmente, volviendo a su estado inicial. La molécula excitada puede sufrir modificaciones, puede transferir ese exceso de energía a otras moléculas o disipar la energía en forma de calor. Ej: Infrarroja, visible y parte de UV.

Radiaciones Electromagnéticas

No poseen masa, solo energía. Ej: Rayos X- Rayos gamma. La E es inversamente proporcional a la longitud de onda (λ). Puede ser ionizante o no ionizante

Se utiliza luz UV generada artificialmente (220-280). A 260 nm, la luz UV es absorbida por ADN y ARN. A este rango, NO es ionizante.

Efecto:

• Efecto fotoquímico en el ADN: Genera fotoproductos → dímeros de timina que interfieren con la replicación y transducción.

• Puede tener efecto letal o mutagénico dependiendo del tiempo y dosis.

Limitaciones de la luz UV:

• Apantallada por el vidrio

• Escaso poder de penetración

Rayos Gamma

Funcionamiento:

• Efecto letal directo: sobre el ADN provocando roturas y entrecruzamientos que no se pueden reparar.

• Efecto letal indirecto: rotura, ionización, formación de radicales libres muy reactivos que rompen y alteran moléculas biológicas esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Caso especial: Fotolisis del agua en la que se generan radicales hidroxilo e H2.

Tiene gran poder de penetración, por lo que está bajo control muy estricto.

Ej: radioisótopos → Cobalto 60 y Cesio 137.

Filtración

Es el método usado en el laboratorio para esterilizar SOLUCIONES TERMOLÁBILES (sensibles al calor) como suero, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos.

Filtro: dispositivo con poros de un tamaño adecuado para impedir el paso de partículas y microorganismos.

Tipos de filtros:

• Profundidad: irregular. Prefiltro para eliminar partículas en grandes soluciones y para cabinas de flujo laminar.

• Membrana: poro regular, para esterilizar soluciones termolábiles.

Agentes esterilizantes químicos

Para esterilizar materiales termolábiles.

Principales agentes esterilizantes utilizados en frío: Aldehídos→ Formaldehído y Glutaraldehído.

Se combinan con ácidos nucleicos y proteínas y los inactivan.

Puede hacerse en líquido o gas (este tarda más). Desventajas: Lentos y producen residuos tóxicos.

Óxido de etileno:

Gas manipulado en cámara hermética (muy tóxico). Produce oxidación y alquidación. Tiene un alto nivel de esterilización y rapidez

Gas-plasma de peróxido de hidrógeno:

Entre líquido y gas (cámara hermética). Forma radicales libres altamente reactivos que destruyen membranas, a.n, proteínas… Rápido y efectivo. No deja ningún residuo pero es muy caro.

Tipos de controles

• Físicos: El operario que realiza el procedimiento y la vigilancia de ciertos parámetros..

• Químicos: Cintas de papel que cambian de color al ser expuestas a las temperatura y humedad buscadas. Pero no dicen el tiempo de exposición transcurrido.

• Biológicos: los más seguros y robustos. Consiste en exponer preparaciones de esporas bacterianas al ciclo de esterilización y luego verificar su viabilidad.

  Se utilizan esporas de Bacillus stearothermophilus (calor húmedo) o Bacillus subtilis (calor seco).