Bioinformatics & regulatory strategies

Vad används för att visa evolutionära förhållanden mellan organismer, proteiner och gener.

Evolutionträd. Längden på varje gren är proportionell mot deras evolutionära distans. För proteiner och gener baseras detta på hur lika deras sekvenser är. T.ex alla hemoglobiner kommer från samma evolutionära linje (de delar samma stamfader)

Förklara divergent evolution

När ett protein utvecklas till protein X och protein Y. De båda proteinerna delar stamprotein och kallas därmed för homologer.

Varför är homologi inte samma sak som likhet mellan proteiner

Likheter i aminosyrasekvenser mellan proteiner kan tyda på homologi men det kan inte betyda att de två proteinerna är homologer. Två proteiner måste dela en stamprotein för att räknas som homologer.

Förklara ortologer

Ortologer är homologa proteiner som finns i olika organismer. De har oftast samma funktion

Förklara paraloger

Det är homologa proteiner som finns i samma organism. De kan ha olika funktioner i organismen

Förklara konvergent evolution

Det är organismer som inte har samma stamfader men som har samma “lösning” på problem. T.ex flygande insekter och fåglar. De har inte samma stamfader men de har båda vingar vilket gör att de kan flyga. Deras proteiner är därför inte heller homologer

Varför är proteinhomologi viktigt att studera

Homologistudier ger oss en inblick på evolution och proteinutveckling. Det hjälper även till att hitta eventuella egeneskaper, funktioner och strukturer hos okände aminosyrasekvenser. Genom att använda liknande proteiner kan man lära sig mer om proteiner som inte vet mycket om.

Hur kan man se ifall två proteiner är homologer

Genom att jämföra aminosyrasekvenser och 3D-strukturer = bioinformatics

Förklara sekvensanpassning

När två peptider/aminosyrasekvenser jämförs måste de oftast anpassas på olika sätt för att likheter ska kunna hittas i sekvensen. Stora likheter indikerar på homologi

Hur kan man anpassa två aminosyrasekvenser för att hitta matchningar

Genom att flytta sekvenserna så att flest matchningar hittas. Vi vissa regioner av sekvenserna måste även “gaps” introduceras vilket innebär att ena sekvensen hoppas längre fram till där den matchar bättre med resten av den andra sekvensen.

Hur hittar man den bästa (flest matchningar) sekvensapassningen

Genom att använda ett poängsystem som mäter hur väl sekvenserna har blivit anpassade —> den anpassningen med flest poäng är den bästa. Poängsystemet baseras på att för varje matchning fås ett visst poäng och för varje gap som tillsätts dras det av med poäng

Hur vet man ifall likheten mellan två sekvenser är signifikant, alltså inte beror av slumpen

Tumregeln är att för sekvenser med 100 aminosyror är 25% identitet signifikant och en indikation på homologi. Men det kan fortfarande vara fel. Att ha lägre än 25% innebär utesluter inte heller homologi för detta är bara en indikation.

Ett mer säkert sätt att undersöka är också sequence shuffling

Förklara sequence shuffling

En av sekvenserna blandas runt så att nya kombinationer av sekvensen matchas med den andra sekvensen. Poäng för varje möjlig sekvenskombination registreras. Om poänget för den orginala sekvensanpassningen är signifikant högre än resten av de blandade sekvenserna så är anpassningen signifikant —> proteinerna är förmodligen homologa

Förklara Blosum 62 matrisen

Det är ett mer precist poängsystem för sekvensanpassning. Det är en matris som ger/tar olika mycket poäng för varje matchning/icke-matchning. På detta sätt tar den även hänsyn till konservativ substitution i sekvenserna. Detta innebär att vissa aminosyror som har substituerats i ena sekvensen fortfarande kan ge poäng om de är kemisk lika (dessa substitutioner sker oftare). Dessa substitutioner påverkar oftast inte proteinet eftersom de är kemiskt lika och därför kan de fortfarande ge poäng i poängsystemet. Poängen baseras på hur sannolikt substitutionen är och relateras till den evolutionära distansen. Större, radikala substitutioner tar längre tid än konservativa substitutioner. Därför ger substitutioner med liknande kemiska egenskaper mellan aminosyrorna högre poäng.

Vad har gap för innebörd i den evolutionära distansen

Varje gap förknippas med evolutionära distans. Därför vill man ha färre och större gaps än många små gaps i en sekvensanpassning om vill hitta likheter.

Vad ska man titta på förutom sekvensen för att hitta homologi

Proteinstrukturerna. Det finns färre strukturer än sekvenskombinationer (strukturen är stabilare) och därför är strukturjämförelser mer känsliga.

Många enzymer följer Michaelis-Menten-kinetiken. Beskriv ekvationen

E + S k₁→←k_-1 ES k₂→ E + P

V = V_max * [S]/(K_M + [S]) där

K_M = (k_-1 + k₂) / k₁

Vid V = V_max/2 gäller att K_M = [S]

Vilka enzym regulatoriska strategier finns det

A) Skapa nya enzymer inklusive isoenzymer (långsam reglering)

B) Reglering av redan existerande enzymer (snabb reglering):

• Allosterisk kontroll

• Reversibel kovalent kontroll

• Proteolytisk aktivitet

Hur fungerar den första regulatoriska strategin (A)

Den är en ganska långsam reglering.

1) Enzymsyntes: alltså transkription/translation

2) Enzymnedbrytning

3) Syntes av en specifik isoenzym

Förklara isoenzymer

Isoenzymer är homologer och har en annan aminosyrasekvens men katalyserar samma reaktion som en annan enzym. De har andra kinetiska parametrar (K_M) och finjusterar metabolismen och ser till behoven för sina specifika vävnader. T.ex hexokinas (i de flesta celler) har hög affinitet till glukos och är alltid aktiv. Medan glukokinas (i levern) har lägre affinitet för glukos och är aktiv vid höga glukoshalter → hjälper till att reglera blodsockernivån

Förklara allosterisk kontroll

Allosteriska regulatorer (effektorer) binder till enzymet (allosterisk enzym) som sedan antingen aktiverar eller inhiberar enzymaktiviteten. Effektorn binder reversibelt på ett annat säte än det aktiva sätet med en icke-kovalent bindning

Allosteriska enzymer har vissa egenskaper. Beskriv de

• De har en T- (tense; minst aktiv) och R-stadie (relaxed; mest aktiv)

• Inbindning av substrat eller allosterisk regulator påverkar skiftet mellan T- och R-stadie

• De består av flera subenheter som samarbetar tillsammans

• Att subenheterna samarbetar tillsammans ger ett S-kurva aktivitet → substratkoncentrationen är en sigmoid funktion

• De följer alltså inte Michaelis-Menten kinetik utan sigmoid funktion

• De får stora förändringar i den tertiära strukturen

• Allosterisk reglering är ett effektivt sätt att reglera dessa proteiner

• Det finns två modeller för allosterisk kontroll: samordnad och sekventiell

Både den samordnade och den sekventiella modellen beskriver hur allosteriska enzymer regleras genom konformationsändringar vid inbindning av ligander. Förklara den samordnade modellen

• Alla subenheter i enzymet existerar samtidigt i antingen en T-form (tense, låg affinitet) eller en R-form (relaxed, hög affinitet).

• När en ligand binder, skiftar alla subenheter samtidigt till R-formen.

• Modellen föreslår alltså en "allt eller inget"-princip, där enzymet snabbt växlar mellan de två tillstånden.

Både den samordnade och den sekventiella modellen beskriver hur allosteriska enzymer regleras genom konformationsändringar vid inbindning av ligander. Förklara den sekventiella modellen

• Enzymets subenheter kan ändra konformation en i taget, snarare än alla samtidigt.

• När en ligand binder till en subenhet, påverkar det grannsubenheterna, vilket gradvis ökar deras affinitet för ytterligare ligander.

  • Detta möjliggör mer stegvis och flexibel reglering av enzymaktiviteten.

Förklara feedback-inhibtion mha ATCase (aspartate transcarbamoylase)

Feedback-inhibtion är när slutprodukten i en syntes inhiberar ett proteins aktivitet genom att allosteriskt binda till den.

ATCase katalyserar en reversibel reaktionen mellan carbamoylfosfat och aspartat där N-carbamoylaspartat bildas. Denna reagerar sedan i en serie reaktioner till slutprodukten cytidintrifosfat (CTP). När tillräckligt med CTP har bildats binder den allosteriskt till ATCase och hämmar dess aktivitet.

Fosforylering/defosforylering är ett vanligt sätt för reversibel kovalent modifiering. Beskriv vad de är

• fosforylering/defosforylering aktiverar/deaktiverar proteiner

• fosforylering sker av proteinkinaser

• desfosforylering sker av proteinfosfataser

• Det leder till en stor förändring i proteinets egenskaper: ±2 negativ laddning och ±2 vätebindningar

• Både snabb och långsam reglering beroende på kinas/fosfataset

• Kinaser kan antingen vara specifika för vissa proteiner eller påverka många olika proteiner (t.ex proteinkinas A)

  • Människor har mer än 550 kinaser

Beskriv proteinkinas A (PKA)

• fosforylerar många olika porteiner

• PKA aktiveras med cAMP som är en intracellulär messenger (second messenger)

• Den aktiveras som respons till en hormonell stimuli: t.ex “fight-or-flight”

• Den består av två regulära och två katalytiska subenheter

• De regulära och katalytiska subenheterna är bundna genom en pseudosubstrat sekvens (-Arg-Arg-Gly-Ala-Ile-)

  • När cAMP binder till de regulära subenheterna bryts bindningen mellan regulära och katalytiska subenheterna → katalytiska subenheterna aktiveras

Förklara proteolytisk reglering

• Vissa proteiner syntetiseras i inaktiva former så kallade: proproteiner/proenzymer = zymogener

• Dessa aktiveras av proteaser när de behövs. Då klyvs zymogener och viks till en aktiv form

• Klyvningen kan ske utanför cellen

  • Proteaser är ofta zymogener

Ge exempel på proteolytisk reglering

• Chymotrypsinogen bildar chymotrypsin mha proteaset trypsin (inaktiv form trypsinogen)

• Hormoner: insulin kommer från proinsulin

  • Apoptosis som utförs av kaspaser som formas av prokaspaser

Vad skiljer proteolytisk reglering från de andra regleringsstratergier

• Proteolytisk aktivitet är inte reversibel

• De aktiverade enzymerna kan bli inaktiva mha inhibitorer