Biochemistry PCR

Transcription ADN obtenu par PCR

Bactéries

Transfert info génétique entre bactéries

Plasmides

Plasmides

Molécule d'ADN circulaire capable de se répliquer de manière autonome

ADN bactérien méthylé ?

Protection contre son propre système antiviral

Système antiviral des bactéries

Enzymes de restriction

Complémentarité ?

Dû aux enzymes de restriction utilisées

Traitement phosphatase

Plasmide ne peut se refermer qu'avec le gène d'intérêt → déphosphorisation de la plasmide

Puis ligase pour connexion gène + plasmide

Charge ADN

Négative car phosphate

Insertion plasmide dans bactérie

Zone d'adhésion → élargie par la chaleur

Cassette de résistance nécessaire

Sélection

Répulsion des attaques nucleophiles

Groupes phosphate et sucre

Nucléoside RNA

Pas de groupe phosphate

Nom dépend du sucre et de la base attachée : nosine

Sauf uridine et cynidine

Nucléosine DNA

Nom dépend du sucre et de la base :

Déoxy+base

Sauf thymide

Purine

Bicyclique

Pyrimidine

Monocyclique

Pyrimidine

D'abord truc monocyclique → bicarbonate

Puis attachement sucre avec PRPP

Puis attachement base ? Uridine est avant la thymide

Modèle de Réplication ADN

Semi conservative

Néo synthèse de l'ADN

Toutes bases azotées

ADN polymerase

ADN parental simple brin intact

Histone

Permet de compacter l'ADN en boules avec la protéine à l'intérieur

Nucleosome

Noyau d'histones →adn entouré autour

Chromosome

1 nucleosome + H1

Compactation des chromosomes

H1s interagissent entre eux pour compacter 6 nucleosomes ensemble = fibre de 30nm

Stockage info génétiques ARN chez certains virus

Retrotranscription en ADN après pour former de l'ARN puis protéines MAIS stocké en ARN car il doit fonctionner comme le truc duquel il dépend

première molécule génétique

ARN (plusieurs type d'ARN

Pourquoi stockage par ADN et pas ARN ?

ADN plus stable et résistante aux mutations

Expérience prouve ARN = précurseur

Pas de thymide sans uridine

Outil de selection (gene oui ou gene non)

Plasmide avec gene bleu si pas de clonage et blanc si clonage

Vérification de clonage

Plasmide + insert à l'inverse = digestion enzymatique avec le même enzyme + gel agarose

Plasmide + insert ?

Digestion enzymatique → recomposition forcée avec l'insert

Southern bolt

Technique de vérification de présence de fragment d'adn

Technique du Southern blot

Fragment d'adn a tester = création d'un marqueur complémentaire dont on peut détecter la présence (ie radioactif)

Étape 1 southern

Digestion enzymatique avec enzyme de restriction (pour obtenir un fragment qui rentre dans le gel d'agarose

Étape 2 Southern

Electrophorese des fragments d'adn double brin

Étape 3 Southern

Solution NaOH = casse les liaisons entre les brins

Étape 4 Southern

Transfert des fragments sur un filtre de nitrocellulose

Étape 5 Southern

Hybridation avec fragments marqueurs (radioactifs ?)

Si on teste plusieurs gène

Electrophorese = fragment de différentes tailles = pas au même endroit

Northern blot

Fragment d'ARN instead of ADN

Étape 1 Northern

Séparation de l'arn “epingle" (?)

Diff northern southern

Northern quantification de l'expression d'un gène

Southern = is it there or not ?

Gêne de référence

Expression reste la même tout le temps = prouve que même quantité de base partout = seul changement est le taux d’expression

Exemple utilisation northern

Dans quelle type de cellule y a t'il le plus d'expression du gène ? (Ie for a virus)

Étapes pcr

1. Dénaturation

2. Hybridation

3. Extension