Deel 4: ICC-experiment

Doel van het experiment (ICC+WB)

functie van het gen Map7 (Microtuble associated protein 7) onderzoeken

Wat kan je doen met ICC (7)

1. bepalen genexpressie

2. lokalisatie

3. bekijken van effect van de expressie van GFP-fusie eiwitten ?

4. Gen knock-out in een zoogdiercellijn

5. kleuren van specifieke structuren in de cel met antilichamen

6. vergelijken van cellulaire structuren en locatie van fusie-eiwitten tussen WT en mutanten

7. bekijken van getransfecteerde cellen met confocale lasermicroscoop

waar staat ICC voor?

immunocytochemische (methode)

Wat doe je via de biochemische methode?

1. bekijken expressie van GFP-fusie-eiwitten via Western Blot

2. de effectiviteit van knockdown bestuderen via RNAi van dit gen

cos-7 cellen

• groot en plat —> handig voor bestuderen van cellulaire lokalisatie en effecten

• Zijn getransfecteerd met verschillende plasmiden met behulp van PEi

PEi

een polymeer die een complex vormt met DNA dat zich daarna kan vastmaken aan een celmembraan

Eindigt in de cel via enodcytosis

Wat willen we bij conditie 1-4 bekijken (zonder deletie van Map-7)
5 dingen itt.

1. De DNA-constructen goed tot expressie kunnen brengen in COS-7- cellen.

2. Met de expressie van GFP-fusies kunnen bepalen waar het eiwit lokaliseert.

3. Een effect kunnen zien van de mutaties op de lokalisatie van het eiwit.

4. Een effect kunnen zien van de expressie van de wildtype/mutante fusie-genen op cellulaire structuren en/of celmorfologie.

5. We met behulp van de mutanten uiteindelijk ook de functie(s) van het eiwit kunnen benaderen en misschien kunnen bepalen welk domein van het eiwit hiervoor belangrijk is

Wat willen we bij conditie 5-6 bekijken (met deletie van Map-7)
2 dingen itt.

1. Een effect kunnen zien van de gen knock-out op cellulaire structuren en/of celmorfologie.

2. We daarmee ook de functie(s) van het eiwit kunnen benaderen.

Wat was het doel van de transfectie met de DNA constructen?

Het doel van de transfectie met de DNA constructen is om de cellen het gewilde eiwit te laten maken (construct). In dit geval BicD2 en Map7

welk stofje fixeert je cellen?

PFA

·       Blok% peremeablisatiebffer (BB) bevat (3)

1. 1x PBS

2. 5% NGS

3. 0,1% Trtiton-X

primaire antilichamen conditie 1-4

• Rat Anti-getyrosineerd-Tubuline (rTT)

• Konijk Anti-gedetyroniseerd-Tubuline (kDT)

primaire antilichamen conditie 5-6

• Konijn Anti-Lamtor4 (kL)

• Muis Anti-GM130 (mG)

• Rat Anti-Tubuline (rT)

secundaire antilichamen conditie 1-4

• Alexa568 Anti-Rat (568 r)

• Alexa647 Anti-konijn (647 k)

secundaire antilichamen conditie 5-6

• Alexa568 Anti-Rat (568 r)

• Alexa488 Anti-konijn (488 k)

• Alexa647 Anti-muis (647 m)