TP3: Electrophorese et chromatographie

I - L’électrophorèse

1. Qu’est-ce que l’électrophorèse et à quoi sert-elle ?

2. Quel est le principe de l’électrophorèse ?

3. Quels sont les principaux critères influençant la migration des molécules en électrophorèse ?

4. Quels sont les types de supports utilisés en électrophorèse et quelles sont leurs différences ?

I - L’électrophorèse

1. Qu’est-ce que l’électrophorèse et à quoi sert-elle ?
   L’électrophorèse est une technique de séparation des molécules biologiques en solution (protéines, acides nucléiques) en fonction de leur charge et de leur taille sous l’effet d’un champ électrique. Elle est utilisée pour l’analyse et le diagnostic biologique.

2. Quel est le principe de l’électrophorèse ?
   Les molécules chargées migrent vers l’électrode de charge opposée. Leur vitesse de migration dépend de plusieurs paramètres, notamment leur charge, leur masse et leur forme.

3. Quels sont les principaux critères influençant la migration des molécules en électrophorèse ?
   La vitesse de migration dépend principalement de trois facteurs :

   • La charge électrique de la molécule : plus elle est chargée, plus elle migre rapidement.

   • La masse moléculaire : les molécules plus petites migrent plus rapidement dans les gels filtrants.

   • La conformation spatiale : une molécule compacte migre plus vite qu’une molécule étendue.

4. Quels sont les types de supports utilisés en électrophorèse et quelles sont leurs différences ?

   • Supports non filtrants : acétate de cellulose, utilisé pour les protéines.

   • Supports filtrants : gel de polyacrylamide (PAGE) et gel d’agarose, utilisés respectivement pour les protéines et les acides nucléiques.

II - Généralités sur la mucoviscidose

5. Quel est le mode de transmission génétique de la mucoviscidose ?

6. Quelle est la fonction normale de la protéine CFTR ?

7. Quel est le rôle des ions chlorures dans les cellules épithéliales ?

8. Combien de mutations du gène CFTR ont été identifiées et quelles sont leurs conséquences ?

• Quel est le mode de transmission génétique de la mucoviscidose ?
  La mucoviscidose est une maladie autosomique récessive, ce qui signifie qu’un individu doit hériter de deux copies mutées du gène CFTR (une de chaque parent) pour être atteint.

• Quelle est la fonction normale de la protéine CFTR ?
  CFTR est un canal ionique présent dans les membranes des cellules épithéliales, facilitant le transport des ions chlorures (Cl−) et jouant un rôle clé dans l’hydratation des muqueuses.

• Quel est le rôle des ions chlorures dans les cellules épithéliales ?
  Les ions chlorures régulent la teneur en eau des muqueuses en maintenant un équilibre osmotique, ce qui permet la fluidité du mucus.

III - Différents types de mutations de CFTR

1. Quels sont les principaux types de mutations du gène CFTR ?

2. Comment certaines mutations empêchent-elles la protéine CFTR d’atteindre la membrane cellulaire ?

3. Quelles mutations entraînent une diminution de la fonctionnalité de la protéine CFTR ?

• Quels sont les différents types de mutations pathogènes du gène CFTR ?
  Les mutations peuvent être classées en plusieurs catégories :

  • Mutations entraînant une absence de CFTR fonctionnelle (exemple : CFTR tronquée).

  • Mutations affectant le trafic intracellulaire (protéine mal transportée).

  • Mutations réduisant la fonctionnalité ou la stabilité de CFTR.

• Comment une mutation de CFTR peut-elle affecter son expression ou son activité ?
  Une mutation peut soit empêcher la production de la protéine, altérer sa structure, perturber son transport vers la membrane, ou réduire son efficacité dans le transport des ions.

• Quelles mutations entraînent une diminution de la fonctionnalité de la protéine CFTR sans affecter son expression ?
  Certaines mutations, comme celles affectant les domaines régulateurs de CFTR, altèrent son efficacité sans empêcher sa synthèse ou son trafic vers la membrane. Par exemple, la mutation G551D empêche l’ouverture du canal malgré sa présence dans la membrane.

IV - Mécanismes de la mucoviscidose dans les voies respiratoires

13. Comment la mutation de CFTR perturbe-t-elle l’hydratation du mucus respiratoire ?

14. Pourquoi la présence d’un mucus épais favorise-t-elle les infections pulmonaires ?

15. Quelles sont les conséquences des infections chroniques sur les poumons ?

16. Comment la fibrose pulmonaire se développe-t-elle dans la mucoviscidose ?

• Comment la mutation de CFTR perturbe-t-elle l’hydratation du mucus respiratoire ?
  Le défaut de transport des ions Cl−Cl^-Cl− empêche l’eau de sortir des cellules, ce qui rend le mucus épais et collant.

• Pourquoi la présence d’un mucus épais favorise-t-elle les infections pulmonaires ?
  Le mucus épais piège les bactéries et réduit l’efficacité des cils bronchiques, favorisant les infections chroniques.

• Quelles sont les conséquences des infections pulmonaires chroniques sur les poumons des patients atteints de mucoviscidose ?
  Les infections répétées entraînent une réaction inflammatoire chronique qui endommage les tissus pulmonaires, provoquant une destruction progressive des alvéoles et une perte de fonction respiratoire.

• Comment la fibrose pulmonaire se développe-t-elle dans la mucoviscidose et quelles en sont les conséquences ?
  La fibrose pulmonaire résulte de la destruction des cellules épithéliales et de la formation de tissu cicatriciel. Cela réduit l’élasticité des poumons et diminue leur capacité d’échange gazeux, aggravant l’insuffisance respiratoire.

V - Symptômes de la mucoviscidose

18. Quels sont les principaux symptômes respiratoires de la mucoviscidose ?

19. Pourquoi les patients atteints de mucoviscidose développent-ils des infections pulmonaires fréquentes ?

20. Comment la mucoviscidose affecte-t-elle la fertilité ?

16. Quels sont les symptômes digestifs de la mucoviscidose et comment impactent-ils la vie quotidienne des patients ?
    Les patients présentent une mauvaise digestion des graisses due à une insuffisance pancréatique, entraînant des douleurs abdominales, une malabsorption des nutriments et un retard de croissance.

17. Pourquoi la mucoviscidose entraîne-t-elle une insuffisance pancréatique et quelles en sont les conséquences ?
    La mutation de CFTR provoque une obstruction des canaux pancréatiques par un mucus épais, empêchant l’écoulement des enzymes digestives, ce qui entraîne une malnutrition et un risque de diabète.

18. Comment la mucoviscidose affecte-t-elle la fertilité chez l’homme et chez la femme ?
    Chez l’homme, la stérilité est fréquente à cause de l’absence des canaux déférents. Chez la femme, la fertilité est réduite en raison d’un mucus cervical trop épais, rendant la fécondation plus difficile.

VI - Épidémiologie

23. Quels sont les principaux symptômes respiratoires de la mucoviscidose ?

24. Pourquoi les patients atteints de mucoviscidose développent-ils des infections pulmonaires fréquentes ?

25. Quels sont les symptômes digestifs de la mucoviscidose ?

26. Pourquoi la mucoviscidose entraîne-t-elle une insuffisance pancréatique ?

27. Comment la mucoviscidose affecte-t-elle la fertilité ?

1. Quels sont les principaux symptômes respiratoires de la mucoviscidose ?

Les symptômes respiratoires sont dus à l’accumulation de mucus épais dans les bronches, ce qui favorise les infections et réduit la fonction pulmonaire. On retrouve :

• Une toux chronique avec expectorations épaisses.

• Un encombrement bronchique rendant la respiration difficile.

• Des infections pulmonaires fréquentes (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus).

• Une insuffisance respiratoire progressive pouvant nécessiter une oxygénothérapie.

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2. Pourquoi les patients atteints de mucoviscidose développent-ils des infections pulmonaires fréquentes ?

La mucoviscidose entraîne une accumulation de mucus épais et collant dans les bronches, ce qui favorise la prolifération des bactéries et empêche leur élimination efficace par le système mucociliaire. Ce milieu pauvre en oxygène et riche en nutriments est propice aux infections chroniques.
Les infections les plus courantes sont dues à Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, bactéries qui développent souvent une résistance aux antibiotiques, compliquant le traitement.

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3. Quels sont les symptômes digestifs de la mucoviscidose ?

Les symptômes digestifs sont liés à l’obstruction des canaux pancréatiques et à une mauvaise absorption des nutriments. Ils incluent :

• Une insuffisance pancréatique exocrine, entraînant un déficit en enzymes digestives.

• Une malabsorption des graisses et des vitamines liposolubles (A, D, E, K).

• Des selles abondantes, grasses (stéatorrhée) et malodorantes.

• Des douleurs abdominales et un transit intestinal irrégulier (constipation, occlusions intestinales).

• Un retard de croissance et une dénutrition, particulièrement chez l’enfant.

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4. Pourquoi la mucoviscidose entraîne-t-elle une insuffisance pancréatique ?

La protéine CFTR étant déficiente, le mucus dans les canaux pancréatiques devient épais et bloque l’excrétion des enzymes digestives vers l’intestin.
Cela entraîne :

• Une mauvaise digestion des lipides et protéines, provoquant une malnutrition et un amaigrissement.

• Une diminution de l’absorption des vitamines liposolubles (A, D, E, K), augmentant les risques de troubles osseux et neurologiques.

• À long terme, cette obstruction des canaux pancréatiques favorise l’inflammation et la destruction du pancréas, pouvant conduire à un diabète mucoviscidosique.

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5. Comment la mucoviscidose affecte-t-elle la fertilité ?

La fertilité est réduite chez les hommes et les femmes, mais pour des raisons différentes :

• Chez l’homme :

  • 98 % des hommes atteints sont stériles en raison de l’absence des canaux déférents (syndrome de l’agénésie congénitale des canaux déférents).

  • La spermatogenèse est normale, mais les spermatozoïdes ne peuvent pas être transportés hors des testicules.

  • Une procréation médicalement assistée (PMA) est possible grâce à des techniques comme la ponction épididymaire.

• Chez la femme :

  • La fertilité est réduite à cause d’un mucus cervical trop épais, rendant plus difficile le passage des spermatozoïdes.

  • Les grossesses sont possibles, mais nécessitent une prise en charge médicale adaptée.

VII - Prise en charge et traitements

26. Existe-t-il un traitement curatif de la mucoviscidose ?

27. Quels sont les traitements visant à améliorer la fonction respiratoire ?

28. Quels traitements médicamenteux sont utilisés pour fluidifier le mucus ?

29. Quels sont les nouveaux traitements ciblant directement la protéine CFTR ?

30. Quelle est la différence entre les correcteurs et les potentiateurs de CFTR ?

1. Existe-t-il un traitement curatif de la mucoviscidose ?

Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif pour la mucoviscidose. La prise en charge repose sur des traitements symptomatiques visant à améliorer la qualité de vie et à ralentir la progression de la maladie.
Cependant, des thérapies géniques et cellulaires sont en cours de développement, avec l’objectif de corriger ou compenser le dysfonctionnement de la protéine CFTR.

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2. Quels sont les traitements visant à améliorer la fonction respiratoire ?

L’amélioration de la fonction respiratoire repose sur plusieurs stratégies :

• Kinésithérapie respiratoire :

  • Mobilisation et drainage du mucus pour prévenir l’encombrement bronchique.

  • Techniques de ventilation assistée si nécessaire.

• Antibiothérapie :

  • Administration d’antibiotiques pour lutter contre les infections pulmonaires fréquentes.

  • Peut être orale, inhalée (ex. tobramycine) ou intraveineuse selon la gravité des infections.

• Anti-inflammatoires :

  • Aident à limiter les lésions pulmonaires dues aux infections chroniques.

  • Les corticoïdes et anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) sont parfois prescrits.

• Bronchodilatateurs :

  • Améliorent l’ouverture des voies respiratoires en facilitant la respiration.

  • Exemples : salbutamol (Ventoline®).

• Greffe pulmonaire :

  • Dernière option pour les patients en insuffisance respiratoire terminale.

  • Améliore la survie, mais nécessite un traitement immunosuppresseur à vie.

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3. Quels traitements médicamenteux sont utilisés pour fluidifier le mucus ?

Les mucolytiques facilitent l’élimination du mucus en réduisant sa viscosité. Parmi eux :

• Dornase alfa (Pulmozyme®) :

  • Enzyme qui dégrade l’ADN des cellules inflammatoires présentes dans le mucus, le rendant plus fluide.

• Sérum salé hypertonique :

  • Favorise l’hydratation du mucus et son évacuation en stimulant le transport de l’eau dans les voies respiratoires.

• Acétylcystéine :

  • Fluidifie les sécrétions bronchiques et limite l’obstruction des bronches.

Ces traitements sont souvent associés à la kinésithérapie respiratoire pour maximiser leur efficacité.

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4. Quels sont les nouveaux traitements ciblant directement la protéine CFTR ?

Les modulateurs de CFTR sont des médicaments récents qui agissent directement sur la protéine CFTR défectueuse pour en améliorer la fonction.

• Ivacaftor (Kalydeco®) :

  • Potentiateur utilisé pour certaines mutations rares comme G551D.

  • Améliore l’ouverture du canal CFTR à la membrane.

• Lumacaftor + Ivacaftor (Orkambi®) :

  • Utilisé pour les patients homozygotes F508del.

  • Lumacaftor aide la protéine CFTR à atteindre la membrane, Ivacaftor optimise son fonctionnement.

• Tezacaftor + Ivacaftor (Symdeko®) :

  • Amélioration d’Orkambi, mieux toléré et plus efficace.

• Elexacaftor + Tezacaftor + Ivacaftor (Trikafta® / Kaftrio®) :

  • Traitement révolutionnaire pour les mutations F508del.

  • Augmente la quantité et l’efficacité de CFTR à la membrane cellulaire.

Ces traitements ont considérablement amélioré l’espérance et la qualité de vie des patients atteints de mucoviscidose.

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5. Quelle est la différence entre les correcteurs et les potentiateurs de CFTR ?

Les modulateurs de CFTR sont divisés en deux catégories principales :

• Correcteurs (ex. Lumacaftor, Tezacaftor, Elexacaftor) :

  • Aident la protéine CFTR mal formée à atteindre la membrane plasmique.

  • Agissent principalement sur la mutation F508del.

• Potentiateurs (ex. Ivacaftor) :

  • Améliorent l’ouverture du canal CFTR déjà présent à la membrane.

  • Indispensables pour les mutations affectant la fonctionnalité du canal.

Dans le cas de mutations comme F508del, une combinaison correcteur + potentiateur est nécessaire pour assurer la présence et le bon fonctionnement de CFTR.

I - Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

1. Quel est le principe de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide ?

2. Quel type de support est utilisé pour l’électrophorèse des protéines ?

3. Quelles conditions permettent de dénaturer les protéines avant électrophorèse ?

4. Quel est le rôle du SDS dans l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide ?

5. Pourquoi utilise-t-on du β-mercaptoéthanol dans cette technique ?

6. Selon quel critère les protéines migrent-elles dans le gel de polyacrylamide ?

I - Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

1. Quel est le principe de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide ?
   L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide permet de séparer des protéines en fonction de leur taille, sous l’effet d’un champ électrique.

2. Quel type de support est utilisé pour l’électrophorèse des protéines ?
   Un gel de polyacrylamide à 10 % est utilisé comme support filtrant.

3. Quelles conditions permettent de dénaturer les protéines avant électrophorèse ?
   Les protéines sont chauffées à 95 °C pendant 5 minutes en présence de SDS et de β-mercaptoéthanol.

4. Quel est le rôle du SDS dans l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide ?
   Le SDS (sodium dodecyl sulfate) dénature les protéines et leur confère une charge négative uniforme, permettant leur migration uniquement en fonction de leur taille.

5. Pourquoi utilise-t-on du β-mercaptoéthanol dans cette technique ?
   Le β-mercaptoéthanol réduit les ponts disulfures, empêchant les protéines de conserver leur structure tridimensionnelle.

6. Selon quel critère les protéines migrent-elles dans le gel de polyacrylamide ?
   Les protéines migrent en fonction de leur taille moléculaire :

• Les petites protéines migrent plus loin dans le gel.

• Les grosses protéines migrent moins loin.

II - Utilisation de l’électrophorèse pour étudier des correcteurs de CFTR

7. Quelles sont les caractéristiques de la protéine CFTR sauvage ?

8. Quelles sont les caractéristiques du mutant G542X de CFTR ?

9. Quel est le rôle de l’antibiotique G418 dans cette expérience ?

10. Quel est l’effet des correcteurs C1 et C2 sur la protéine CFTR mutante ?

11. Quels sont les différents dépôts réalisés sur le gel d’électrophorèse pour cette étude ?

7. Quelles sont les caractéristiques de la protéine CFTR sauvage ?

• Forme complète et fonctionnelle.

• Composée de 1480 acides aminés.

• Masse moléculaire de 170 kDa.

8. Quelles sont les caractéristiques du mutant G542X de CFTR ?

• Protéine tronquée et non fonctionnelle.

• Composée de 541 acides aminés.

• Masse moléculaire de 52 kDa.

9. Quel est le rôle de l’antibiotique G418 dans cette expérience ?
   Le G418 provoque des erreurs de traduction, permettant parfois la production d’une forme partiellement fonctionnelle de CFTR mutée.

10. Quel est l’effet des correcteurs C1 et C2 sur la protéine CFTR mutante ?
    Les correcteurs C1 et C2 favorisent le bon repliement et la stabilisation de la protéine CFTR mutante dans le réticulum endoplasmique, augmentant ainsi sa quantité fonctionnelle à la membrane.

11. Quels sont les différents dépôts réalisés sur le gel d’électrophorèse pour cette étude ?

• CFTR sauvage (protéine complète).

• Mutant G542X seul (protéine tronquée).

• Mutant G542X traité avec G418 + C1 + C2 pour observer si les correcteurs améliorent la quantité de CFTR détectable.

1. Principe de la chromatographie

• Qu'est-ce que la chromatographie et à quoi sert-elle ?

• Quel est le principe de la chromatographie de partage en couche mince ?

• Quels sont les composants d’un système chromatographique utilisé ici ?

• Quelle est la différence entre la phase stationnaire et la phase mobile ?

• Comment sont séparées les molécules lors de la chromatographie de partage ?

• Que peut-on conclure sur la solubilité des molécules en fonction de leur migration ?

1. Qu'est-ce que la chromatographie et à quoi sert-elle ?
   La chromatographie est une technique de séparation et d’identification des molécules d’un mélange en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Elle est utilisée pour analyser des pigments, des protéines, des acides aminés ou d'autres composés biologiques.

2. Quel est le principe de la chromatographie de partage en couche mince ?
   Ce type de chromatographie repose sur la répartition des molécules entre une phase stationnaire (fixe) et une phase mobile (solvant). Les molécules les plus solubles dans la phase mobile migrent plus loin, tandis que celles qui interagissent fortement avec la phase stationnaire migrent moins.

3. Quels sont les composants d’un système chromatographique utilisé ici ?

   • Support : Film de cellulose fixé sur une plaque d’aluminium.

   • Phase stationnaire : Phase aqueuse à base d’ammoniaque, qui imbibe le support.

   • Phase mobile : Phase organique (propanol) qui migre sur le support et entraîne les molécules solubles.

4. Quelle est la différence entre la phase stationnaire et la phase mobile ?
   La phase stationnaire est fixe et adsorbe certaines molécules, ralentissant leur migration. La phase mobile, quant à elle, entraîne les molécules plus solubles et les fait migrer sur le support.

5. Comment sont séparées les molécules lors de la chromatographie de partage ?
   Les molécules se déplacent à différentes vitesses selon leur solubilité dans la phase mobile et leur interaction avec la phase stationnaire. Plus une molécule est soluble dans la phase mobile, plus elle migre loin.

6. Que peut-on conclure sur la solubilité des molécules en fonction de leur migration ?

   • Les molécules les plus solubles dans la phase mobile organique migrent le plus loin.

   • Les molécules qui interagissent davantage avec la phase stationnaire aqueuse migrent le moins.

2. Étude des pigments de l'œil de drosophilePARTIE Q (QUESTIONS)

7. Quels sont les deux principaux pigments présents dans l'œil de la drosophile ?

8. Où se trouvent ces pigments dans l'œil de la drosophile ?

9. Quelles sont les caractéristiques de la souche sauvage en termes de pigmentation ?

10. Quelle différence existe entre les drosophiles mâles et femelles au niveau des yeux ?

11. Quelle est la composition chimique des pigments bruns et rouges ?

7. Quels sont les deux principaux pigments présents dans l'œil de la drosophile ?

   • Ptérines : pigment rouge

   • Ommochromes : pigment brun

8. Où se trouvent ces pigments dans l'œil de la drosophile ?
   Ils sont situés dans des granules pigmentaires à l'intérieur des ommatidies, les unités visuelles de l'œil de la drosophile.

9. Quelles sont les caractéristiques de la souche sauvage en termes de pigmentation ?
   La souche sauvage possède un mélange équilibré des pigments rouges et bruns, ce qui donne une couleur brique à l'œil.

10. Quelle différence existe entre les drosophiles mâles et femelles au niveau des yeux ?
    Le mâle présente un anneau brun appelé corolle au niveau de l’anus, et la femelle est environ 20% plus grande que le mâle.

11. Quelle est la composition chimique des pigments bruns et rouges ?

• Drosoptérine : pigment rouge issu de la voie des ptérines.

• Xanthommatine : pigment brun issu de la voie des ommochromes.

3. Biosynthèse des pigments et mutations

12. Quels sont les précurseurs chimiques des pigments rouge et brun ?

13. Comment se déroule la biosynthèse des ommochromes ?

14. Comment se déroule la biosynthèse des ptérines ?

15. Quelles sont les conséquences d’une mutation affectant une enzyme de biosynthèse ?

16. Quelles mutations entraînent des yeux blancs ou sépia chez la drosophile ?

12. Quels sont les précurseurs chimiques des pigments rouge et brun ?

• Ommochromes : issus du tryptophane.

• Ptérines : dérivés de la guanosine triphosphate (GTP).

13. Comment se déroule la biosynthèse des ommochromes ?

• Trois enzymes (Ea, Eb, Ec) transforment progressivement un précurseur (A) en un pigment brun final.

• Chaque gène (a, b, c) code pour une enzyme spécifique.

14. Comment se déroule la biosynthèse des ptérines ?

• Trois enzymes (E1, E2, E3) transforment progressivement un précurseur (W) en un pigment rouge final.

• Chaque gène (1, 2, 3) code pour une enzyme spécifique.

15. Quelles sont les conséquences d’une mutation affectant une enzyme de biosynthèse ?

• En amont : accumulation de métabolites intermédiaires.

• En aval : déficit du pigment final, entraînant une modification de la couleur de l'œil.

16. Quelles mutations entraînent des yeux blancs ou sépia chez la drosophile ?

• Mutation d’une enzyme de la voie des ommochromes → yeux rouges.

• Mutation d’une enzyme de la voie des ptérines → yeux marron.

• Mutation des deux voies simultanément → yeux blancs.

4. Expériences de chromatographie

• Quel est l’objectif de la chromatographie sur les pigments de drosophile ?

• Pourquoi utilise-t-on un mélange propanol/ammoniaque comme solvant ?

• Pourquoi les ommochromes ne migrent-ils pas dans ces conditions ?

• Comment identifier les pigments après séparation ?

• Quel est l’objectif de la chromatographie sur les pigments de drosophile ?
  Séparer et analyser les pigments de l’œil de drosophile en fonction de leur solubilité dans un mélange solvant.

• Pourquoi utilise-t-on un mélange propanol/ammoniaque comme solvant ?
  Ce mélange permet de solubiliser préférentiellement les ptérines (pigments rouges) et de les séparer efficacement.

• Pourquoi les ommochromes ne migrent-ils pas dans ces conditions ?
  Les ommochromes (pigments bruns) sont insolubles dans le mélange propanol/ammoniaque et restent donc au niveau du dépôt.

• Comment identifier les pigments après séparation ?
  En comparant les bandes obtenues avec des témoins de pigments purifiés (drosoptérine pour les rouges, xanthommatine pour les bruns).