20.4: Regeling van genexpressie in eukaryoten: post-transcriptionele controle (3de - 4de - 5de niveau)

slide niveaus van controle

slide schema

wat is 3e niveau van regeling van de genexpressie bij eukaryoten

regeling van RNA processing en nucleaire export

wat gebeurt er bij alternatieve splicing en polyadenylering

Regulatorische proteïnen en snoRNAs binden op splicing enhancer en silencer sequenties van het pre-mRNA (kunnen zoxel in exon als intron gelegen zijn)

Hoe gebeurt 3’ polyadenylering

• Polyadenylatieplaats tussen AAUAAA seq en G/U seq (: GU rijke en of U-rijke seq)

• Knipping 10-35nt stroomafwaarts van AAUAAA seq

• toevoeging van polyAstaart door polyApolymerase (zonder template)

• 3’ processing leidt ook tot terminatie van transcriptie

• uitzondering transcripts zonder polyAstaart

• functie

  • bescherming tegen exonucleasen

  • betrokken bij export van mRNA uit de kern naar cytoplsma

  • betrokken bij initiatie van translatie

slide alternatieve polyadenylering en splicing

slide ter illustratie

wat gebeurt er met mRNAs die geen EJC gebonden hebben

worden afgebroken in de kern (zoals alle defecte mRNAs)

welke soort mRNAs worden wel geëxporteerd uit de kern en gebeurt dit altijd spontaan

Enkel mature mRNAs (met EJC gebonden) worden geëxporteerd als mRNP doorheen de kernporieën (Ran onafhankelijk)

Soms stimulus-gergelde export

bv HUV viru synthtiseerd Rev proteine dat een NES (nucleair export signaal) hheeft

het Rev bindt HIV in de kern en brengt dit RNA naar het cytoplasma door de nucleaire poriën zodat het afgeschreven kan worden

slide initiatie translatie bij eukaryoten

slide inhibite eIF2

hoe gebeurt de regeling an translatie via eIF2 fosforylering?

• in aanwezigheid van heem: globine synthese in erythrocyten (>90% van alle eiwitten), het eiwitkinase HCI (heem controlled inhibitor) is inactief → translatie kan optreden

• In afwezigheid van heem: het eiwitkinase HCI fosforyleert eIF2 → inhibeert eIF2 en leidt tot blokkering van initiatie van translatie

wordt eIF4E ook inactief door fosforylering

nee, omgekeerde van eIF2

eIF4E wordt net geactiveerd door de fosforylering

slide bordschema

slide initiatie translatie eukaryoten

wat is eIF4F

complex van eIF4E, eIF4G, eIF4A

waar bindt eIF4E

aan de 5’ cap van mRNA

is eIF4E actief of inactief bij fosforylering

actief

hoe en waarom blokkeren sommige virussen de fosforylering van eIF4E

Sommige virussen produceren een protease dat eIF4G proteolyseert in 2 stukken (hierdoor geen translatie van cellulaire mRNAs en wel van virale mRNAs)

• 1 fragment bindt aan 5’ cap via binding op eIF4E

• ander fragment vindt op IRES (international ribosome entry sequence) van viraal mRNA, zodat er wel translatie is van virale mRNA en cellulaire

slide initiatie van translatie

hoe gebeurt regeling van translatie via translationele repressor

• ferritine = intracellulaire stockage van Fe

  • het zal dus gesynthetiseerd moeten worden wanneer er veel Fe aanwezig is

• veel ferritine nodig bij hoge ijzerconcentratie → synthese selectief gestimuleerd door Fe

• IRE = ijzer-respons element in 5’ UTR

• IRE-bindingseiwit = translationele repressor en allosterisch eiwit (heeft dus 2 conformaties en kan een effectormolecule binden, nl Fe kan zorgen voor verandering van de 3D structuur)

• Bij lage concentratie aan ijzer bindt de translationele repressor (IRE bindins eiwit) zodat er geen translatie is van ferritine mRNA.

• want 43S pre-initiatie complex van het ribosoom wordt eerst gevormd aan de cap → dan scant het (beweegt over het mRNA tot het AUG tegenkomt)

• normaal zou hier initiatie gebeuren, dat zal hier niet gebeuren omdat de scanning wordt geblokkeerd door translationele repressor).

functie TRANSLATIONELE repressor

controleert translatie van een specifiek mRNA door binding op een respons element in mRNA

slide Fe aanwezig

met welke experimenten kun je de halfwaardetijd van mRNA nagaan

Pulse-chase experimenten (radioactief nucleotiden toevoegen en kijken wanneer ze afgebroken zijn)

wat bepaalt de levensduur van een mRNA

• lengte polyAstaart

• aantal AU-rijke elementen in 3’ UTR (hoe meer, hoe minder stabiel)

Hoe gebeurt de rgeling van mRNA afbraak via ijzer

Dit gebeurt bv bij mRNA voor transferrine (een transmembranair eiwit dat verantwoordelijk is voor transport van Fe naar de cel, nodig wanneer [Fe] laag is).

IRE bindend eiwit (translationele repressor) bindt in IRE in 3’ UTR en zorgt er zo voor dat het mRNA niet wordt afgebroken wanneer [Fe] laag is

Bij een hoge Fe concentratie moet transferrine niet aangemaakt worden → Fe bindt op traslationele repressor en deze zal niet meer op het IRE binden → IRE is vrij en kan worden afgebroken

slide afbraak mRNA

hoe gebeurt mRNA afbraak via exosoom of P-bodies

• 3’ → 5’ pathway: uitgevoerd door cytoplasmatisch exosoom

  • inkorten polyAstaart (3’ uiteinde)

  • verwijderen van polyAbindende proteïnen

  • degradatie van mRNA in de 3’ → 5’ richting door exonucleasen van cytoplasmatisch exosoom

  • afbraak 5’ cap door Cap-afbrekende enzymen

• 5’ → 3’ pathway

  • inkorten polyAstaart

  • verwijderen 5’ cap

  • afbraak mRNA in 5’ → 3’ richting door exonucleasen gelocaliseerd in een cytoplasmatische structuur gekend als P-bodies (mRNA processing bodies)

slide bordschema

wat is RNA interference

(RNAi)

RNA-gemedieerde inhibitie van genexpressie

slide kleine RNA’s

waardoor wordt RNAi respons vesterkt

RNA afhankelijk RNA pol

waarvoor staat siRNA

small interfering RNA

waarvoor staat siRISC

RNA induced silencing complex

Hoe werken siRNAs

• Plantencel / C;elegans wordt geïnfecteerd met een virus, het injecteert zijn genoom (dsRNA)

• In het cytoplasma zit een ribonuclease dat dsRNA in stukken zal knippen. Zo krijg je siRNAs (= kleine stukken dsRNA) → DICER

• RISC eiwitten herkennen siRNA’s

• siRISC complex wordt gevormd → 1 van de eiwitten is argonaut (ook een ribonuclease → breekt RNA af)

• 1 van beide strengen wordt afgebroken en we krijgen ss siRNA met eiwitten (waaronder argonaut)

• 2 opties:

  • Hoofdweg:

    • complementaire siRISC bindt op viraal mRNA

    • Als het 100% complementair is, zal het mRNA worden afgebroken.

    • Als het niet 100% complementair is, zal de translatie geïnhibeerd worden, maar blijft het mRNA

  • Niet-hoofdweg:

    • siRISC gaat naar nucleus → binding aan DNA → rekrutering DNA- of histon methyltransferasen

waarvoor staat miRNA

micro RNA

codeert miRNA voor een eiwit

nee, er zijn miRNA coderende genen in het lichaam

hoe werke miRNAs

• Transcriptie → pri-miRNA

• Drosha (= nucleair ribonuclease) knipt pri-miRNA en je krijgt pre-miRNA

• pre-miRNA gaat naar cytosol

• Dicer in cytosol knipt pre-miRNA in kleine ss miRNA

• 1 van de 2 strengen wordt afgebroken, de andere wordt bezet met eiwitten

• 2 opties

  • Hoofdweg:

    • het miRNA hybridiseert op mRNA obv partiële complementariteit (dus niet 100%), dus 1 miRNA kan op verschillende mRNAs binden

    • We krijgen inhibitie van translatie, maar mRNA blijft

    • het mRNA:miRNA complexen worden gestockeerd in P-bodies

    • Als de cel het dan nodig heeft, kan het uit de P-bodies komen → miRNA afbreken → kan weer translatie gebeuren

  • Niet hoofdweg:

    • miRNA is 100% complementair aan mRNA → mRNA wordt afgebroken

hoeveel mRNAs kan een miRNA binden, is dit reversibel of niet

1 miRNA kan ongeveer 200 verschillende mRNAs reversibel binden

kan 1 mRNA door verschillende miRNAs gebonden zijn

ja

waarvoor staat piRNA

Piwi-interacting RNAs

waarvan zijn piRNAs afkomtig

van lange ssRNA

Hoe worden piRNAs afgeschreven

piRNAs worden afgeschreven van een piRNA cluster (is genomische en zit in elke cel, maar komt niet in elke cel tot expressie) die bestaat uit stukjes van transposon DNA

wat is de piwi familie

piwi familie (behoren tot de argonaut proteïnen en hebben dus ribonucleaseactiviteit) binden de piRNAs in een RISC complex (piRISC)

waar binden piRNAs op en wat is het gevolg

wat doen ze nog

• RNA dat afgeschreven is van een transposon met RNA afbraak tot gevolg

• op transposons DNA en inhibeert de transcriptie (moet dus naar kern) (2e niveau van regulatie)

→ beschermen ook tegen transposon activiteit

waar komen piRNAs hoofdzakelijk tot expressie en waarom

in geslachtscellen → moeten beschermd worden tegen transposon activiteit

slide siRNA

slide miRNA

slide piRNA

ribonuclease is NIET dicer

slide siRNA-mRNA-Argonaut complex

RNAi: hoe kun je ds RNA binnenbrengen

• Via injectie: blijkt wel een RNAi respons te geven

• via ds RNA virussen: geen RNAi → werkt enkel bij planten en C-elegans en dus niet bij de mens

• via een plasmide dat een inverted repeat tot expressie brengt dat een haarspeld structuur zal aannemen (want inverted repeat geeft aanleiding tot interne complementariteit)

als we geen siRNAs hebben, hoe kunnen we dan onzelf beschermen tegen virale infecties

interferon respons element

hoe doe je een genoom-wijde RNAi screen in C. Elegans

• voor elk gen van C. Elegans wordt een bacterie genetische gemodificeerd

• met PCR gen van ons interesse amplificeren

• gen insereren in een plasmide

• Plasmide in E. Coli doen

• Plaat met welletjes: in elk welletje zijn bacteriën met een plasmide (elk stukje een andere plamide corresponderen dmet het gen)

• in elke welletje worden C. Elegans gestoken

• de wormen zullen de bacteriën opeten en zo komt het dsRNA vrij.

• het gen wordt uigeschakeld in alle cellen

• sommige wormen zullen afsterven en dan weet men welke de essentiële genen zijn bij uitschakeling → lethaal

bordschema

slide schema

op welke manier is therapeutisch gebruik van RNAi mogelijk

• bv als een gen te actief is in kanker een miRNA toevoegen om het uitschakelen

• miRNA coderende genen bevatten soms mutaties, als een miRNA niet functioneel is in de cel kan het tot een fenotype leiden afhankelijk van hoe drastisch de functie beïnvloed wordt.

Door 1 miRNA te muteren verander je de translatie van meerdere genen.

Een onderzoeker voegt een siRNA toe aan een humane cel om de genexpressie van gen A uit te schakelen.

Het siRNA zal een sequentie hebben dat identiek is aan de

a) intron van gen A

b) exon van gen A

c) promotor van gen A

d) enhancer van gen A

b

mRNA heeft geen promotor

waarvoor staat lncRNA

long noncoding RNA

coderen lncRNA voor een eiwit

nee

wat brengen lncRNA tot expressie

RNA

waarmee overlappen LncRNA genen

40% overlap met proteïne coderende genen

heeft een LncRNA een promotor

ja

doet LncRNA trans of cis inhibitie

cis

wat is cis inhibite door LncRNA

inhibitie van transcriptie van dichtbij gelegen genen en / of chromosomen

vb van cis inhibitie door lncRNA

Xist RNA

een RNA pol zal het eiwitcoderend gen afschrijven, een RNA pol zal ook het LncRNA afschrijven.

De RNA pol kunnen botsen tegen elkaar, wat kan het effect hiervan zijn

beïnvloedt transcriptie

wat is een sense lncRNA

een lncRNA dat overlapt met een eiwitcoderend gen in dezelfde richting

wat is een antisense lncRNA

een lncRNA dat overlapt met een eiwitcoderend RNA in de andere richting

wat is een bidirectionele lncRNA

een lncRNA met een bidirectionele promotor (verschillende richtingen) op minder dan 1000 bp van eiwitcoderend gen

wat is een intronisch lncRNA

een lncRNA dat ligt in een intron van een eiwitcoderend gen

wat is een intergenisch lncRNA

een lncRNA dat ligt tussen 2 eiwitcoderende genen

wat ka lncRNA nog doen naast transcriptie inhiberen van dichtbij gelegen genen en / of heel chromosoom

lncRNA kan associëren met het chromatine modificerende/regulerende eiwitten en deze ribonucleocomplexen targeten naar een andere locus

Hoe werkt Xist RNA

Het werkt in Cis

• het X-chromosoom dat geïnactiveers zal worden zal transcriptie doen van Xist RNA gen doen waardoor Xist RNA tot expressie komt

• Xist RNA verspreid zich over het gehele X-chromosoom dat geïnactiveerd wordt

• chromatine modificerende enzymen worden gerekruterd en dat leidt tot stilleggen transcriptie

Xist RNA is een vb van hoe lncRNA genen die in de buurt liggen / chromosomen in cis kunnen inhiberen, wat is een vb van hoe lncRNA ribonucleocomplexen kan targeten naar een andere locus

HOTAIR

inhibeert HOTAIR in cis of trans

trans

waarvoor staat HOTAIR

Hox antisense intergenic RNA

wat doet HOTAIR

het inhibeert in trans: ht inhibeert een gen op een ander chromosoom

het is gesynthetiseerd in de HOXC cluster, maar regelt de expressie in de HOXD cluster dat gelegen in op een ander chrosmosoom.

HOTAIR associeert en target het PRC2 naar HOXD locus

slide bordschema

wat zijn omkeerbare post-translationele modificaties

(de)fosforylering

(de)deacetylering

(de)methylering

voorbeeld van permanente modificatie

proteolytische knipping (bv processing insuline)

welke eiwitten regelen eiwitvouwing

moleculaire chaperones

wat is het doel van eiwittargeting

eiwitten naar intra- en intercellulaire locaties

vb van eiwitten naar intercellulaire locaties

secretie buiten de cel

welke molculen kunnen eiwitactiviteit reguleren

regulatorische moleculen of ionen bv cAMP Ca2+

wat bepaalt de concentratie van een eiwit in een cel

snelheid van synthese en afbraak

wat is de formule voor eiwitconcentratie

P = k_syn/k_deg

snelheid eiwitsynthese / snelheid van eiwitafbraak

waartussen kan de halfwaardetijd van eiwitten variëren

minuten tot weken

wat gebeurt er als synthese en afbraak van eiwitten in balans zijn

eiwitconcentratie blijft stabiel

Hoe gebeurt eiwitdegradatie door proteasomen

• Ubiquitine wordt aan E1 (ubiquitine activerend enzyme) gebonden

• ubiquitine wordt doorgegeven van E1 naar E2 (ubiquitine-conjugerend enzym).

• Ook E3 (ubiquitine ligase) bindt eraan, het markeert eiwitten die afgebroken moeten worden en zorgt dat ubiquitine op E2 getransereerd wordt naar Lys in het target eiwit dat moet afgbroken worden (dit is poly-ubiquitine → meerdere ubiquitines komen op een eiwit, meerder Lys kunnen ge-ubiquitineerd worden en op 1 Lys kunnen meerdere ubiquitines zitten.

• Wanneer de ubiquitines gebonden zijn op de Lys van het af te breken eiwit, zullen E2 en E3 dissociëren

• Het ge-ubiquitineerde eiwit wordt herkend door proteasoom

• het proteasoom hydrolyseert de eiwitten tot kleine peptiden

wat is ubiquitine

een klein peptide van 76 AZ’en

heeft een proteasoom ATP nodig

ja

slide Angelman syndroom en Prader-Willi syndroom

Hoe werkt APOBEC3G en hoe wordt het geïnhibeerd

DNA-editing enzyme bv. deoxycytisine deaminase APUBEC3G → deamineert cytosine naar uracil in ss DNA

APOBEC3G is een antivirale factor

APOBEC3G activatie leidt tot G-A hypermutaties in DNA, waardoor retrovirus geïnactiveerd wordt

Het HIV virus produceert eiwitten die het APOBEC3G uitschakelen (bv Vif (viral infectivitey factor) bindt op APOBEC3G waarna het ge-ubiquitineerd wordt en vervolgens afgebroken door proteasomen).

op welke manier kunnen we aan eiwitafbraak doen

• ubiquitinering gergelde eiwitafbraak (ook defecte eiwitten worden geUb en dan afgebroken door proteasoom)

• Sumoylering (Small ubiquitin-related modifiers, SUMOs, peptiden) regelt eiwitstabiliteit, nucleoplasmtisch transport en functie van transcriptiefactoren.

• Eiwitafbraak via lysosomen (microautofagie); niet altijd selectief

welk ligase bepaalt welk residu in welk eiwirt wordt geUb (substraat specificiteit)

E3 ubiquitine ligase

E3 ubiquitine ligasen herkennen bepaalde sequenties, welke

• N-terminale AZ’en

• Interne AZ seq, gekend als DEGRONS

slide overzicht bordschema

slide ter illustratie

slide ter illustratie