Biochemia ćwiczenie V -dehydrogenaza bursztynianowa i wit.C

oksydoreduktazy to klasa

EC1

oksydoreduktazy katalizują

reakcje utleniania i redukcji

grupy oksydoreduktaz

dehydrogenazy, oksydazy, oksygenazy, hyperoksydazy

dehydrogenazy

katalizują reakcje przenoszenia równoważników redukujących elektrony i protony między substratami, nie wykorzystują jako akceptora atomów H2 atomów O2 tylko kofaktory - NAD+, NADP+, FAD, FMN

reduktazy

podgrupa dehydrogenaz, katalizują przeniesienie na substrat równoważników redukujących z NADPH + H+

oksydazy

katalizują reakcje utlenienia substratu z jednoczesną dwu lub czteroelektronową redukcją tlenu do nadtlenku wodoru lub wody

przykłady oksydaz

cytochromowa, oksydaza L Daminokwasowa, oksydaza polifenolowa

oksygenazy

katalizują reakcję utleniania związków organicznych poprzez wbudowanie do nich atomów tlenu pochodzących z cząsteczki O2, synteza degradacja metabolitów. mono i dioksygenazy

monooksygenazy/hydroksylazy

katalizują reakcję wprowadzenia do cząsteczki substratu tylko 1 atomu z tlenu cząsteczkowego, drugi atom ulega redukcji do wody. reakcja enzymatyczna wymaga obecności dodatkowego donora e- (reduktora) np. NADPH++H+, tetrahydrobiopetryny. powstaje grupa hydroksylowa KOFAKTOREM JEST WITAMINA C

monooksygenazy funkcja

uczestniczą w biosyntezie hormonó katecholowych (hydroksylaza tyrozynowa, dopaminowa), hydroksyproliny w kolagenie (hydroksylaza prolilowa), kwasów żółciowych ( 7-alfahydroksylaza) oraz hormonów steroidowych. metabolizm ksenobiotyków, cytochrom P-450

dioksygenazy

katalizują reakcje przyłaczania obu atomów O2 cząsteczkowego

dioksygenazy uczestniczą w

kataboliźmie tryptofanu (dioksygenaza tryptofanowa)

Tyrozyny (dioksygenaza homogentyzynianowa)

hydroperoksydazy

katalizują reakcje rozkładu H2O2, zawierają żelazoporfirynę, dzielą się na peroksydazy, katalazę

peroksydazy

katalizują reakcje rozkładu H2O2 lub nadtlenków organicznych, utlenianie związków organicznych będących donorami elektronu - askorbinianu, zred. cytochromu c, fenoli, amin

peroksydazy mogą być pochodzenia

roślinnego bądź zwierzęcego

peroksydaza glutationowa

selenoproteina, ważna rola w erytrocytach, kataliza reakcji redukcji H2O2, nadtlenków organicznych z jednoczesnym utlenieniem zredukowanego glutationu zapobiegając utlenieniu hemoglobiny i lipidów błon komórkowych

peroksydazy są odporne na

temperaturę 70C, inaktywacji ulegają po ogrzaniu w łaźni wodnej

katalaza

hemoproteina, enzym wszystkich organizmów tlenowych, zawiera jony żelaza w postaci hemowej. katalizuje rozkład H2O2 → H2O + O2

rozkład H2O2 katalizowany przez katalazę

szczególny przypadek reakcji hydroperoksydazowej gdzie 1 cz. H2O2 jest donorem a druga akceptorem H+

katalaza aktywna jest w

erytrocytach, wątrobie, nerkach

koenzymy nikotynamidowe

dinukleotydy posiadające grupę czynną - amid kwasu nikotynowego (pochodna pirydynowa) NAD+ (dinukleotyd nikotynamidoadeninowy)

NADP+ (fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego NADP+

koenzymy nikotynamidowe powstają

endogennie w organiźmie z kwasu nikotynowego (niacyna, B3)

budowa koenzymów nikotynamidowych

zbudowane z dwóch nukleotydów (nikotynamidowego/adeninowego) połączonych wiązaniem pirofsforanowym, amid kwasu nikotynowego, adenina, dwie reszty rybozy, dwie grupy fosforanowe

budowa NADP+ fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego

posiada dodatkową grupę fosforanową przy at.C-2’ rybozy w nukleotydzie adeninowym

NAD+ NADP+ funkcja

koenzymy dehydrogenaz, przenoszą równoważniki redukujące p+, e-

grupa aktywna NAD+ NADP-

pierścień pirydynowy w strukturze nikotynamidu, posiadający dodatkowy ładunek na azocie

ze względu na dodatni ładunek w pierścieniu pirydyny atom węgla znajdujący się w pozycji para do azotu jest

ubogi w elektrony i łatwo może przyłączać proton oraz dwa elektrony w postaci jonu wodorkowego H+ (H++2e-=H-). drugi z oderwanych przez dehydrogenazę H+ pozostaje w środowisku. w wyniku tej reakcji powstaje NADH++H+

NADP+ NAD+ są nietrwale związane z

apoenzymem, mogą współpracować z różnymi enzymami

NAD+ wykorzystywany jest w procesach

katabolicznych, w których jest akceptorem równoważników redukujących od substratów utlenianych i następnie wprowadza je do mitochondrialnego łańcucha oddechowego

NADPH+ H+ uczestniczy w procesach

anabolicznych, syntezach redukcyjnych - cholestreolu, kw.tłuszczowych, kw. żółciowych, hormonów sterydowych

nukleotydy flawinowe

FMN - mononukleotyd flawinowy

FAD - dinukleotyd flawoadeninowy

nukleotydy flawinowe są grupami

prostetycznymi enzymów z klasy oksydoreduktaz określanych jako flawoproteiny. uczestniczą w procesach utleniania biologicznego, składniki łańcucha oddechowego, katalizują reakcję transportu elektronów w łańcuchu (dehydrogenazy flawinowe)

enzymy flawinowe mogą pośredniczyć w reakcjach

przenoszenia p+ i e- ze zredukowanych koenzymów nikotynamidoadeninowych na inne akceptory

do flawoprotein zalicza się również

oksydazę D i L-aminokwasową

nukleotydy flawinowe są pochodnymi

ryboflawiny (b2) - heterocykliczny, trójpierścieniowy układ dimetyloizoalloksazyny z rybitolem

FMN powstaje w

ATP-zależnej reakcji fosforylacji ryboflawiny

FMN zbudowany jest z

dimetyloizoalloksazyny, rybitolu, reszty fosforanowej, nie zawiera w strukturze rybozy

rybitol

alkohol cukrowy powstający w wyniku redukcji rybozy

najczęściej kofaktorem oksydoreduktaz jest

dinukleotyd flawinoadeninowy FAD

FAD składa się z

FMN + AMP połączone wiązaniem pirofosforanowym

FAD i FMN podczas reakcji redoks przyjmują

2 e- i 2 H+

grupa czynna nukleotydów flawinowych

pierścień dimetyloizoalloksazyny - uczestniczy w przenoszeniu p+ i e-

przyłączenie 2p+ i 2e- do atomów azotu pierścienia dimetyloizoalloksazyny prowadzi do

powstania zredukowanych form nukleotydów flawinowych FMNH2 FADH2

co różni nukleotydy flawinowe od NAD+ NADP+

są trwale związane z apoenzymem, są grupami prostetycznymi bo nie mogą oddysocjować

kwas L+ askorbinowy

wit. C należy do witamin rozpuszczalnych w wodzie, nie jest kwasem, nietrwały

niskie ph roztworów witaminy C zależy od

obecności grup enolowych w cz.

wit. C wykazuje wrażliwość na

zasadowe ph, podwyższoną temperaturę, dostępność tlenu

wit. C w obecności tlenu i jonów metali

utlenia się do nieaktywnych pochodnych,

wit. C może utleniać się

w obecności oksydaz - askorbinazy - świeże ogórki

kwas askorbinowy może być syntetyzowany

w komórkach zwierzęcych z glukozy w szlaku kw. uronowego

człowiek nie syntetyzuje wit. C ponieważ

brak jest enzymu oksydazy L-gulonolaktonowej

dzienne zapotrzebowanie wit. C dla człowieka

1 mg/kg (ok.60mg/doba) - największe spośród witamin

dużą zawartość wit. C mają

świeże owoce, warzywa - acerola, aronia, czarna porzeczka, dzika róża, czerwona papryka, natka pietruszki

witamina C wchłaniana jest

w jelicie cienkim

wit. C występuje w organiźmie

w płynach pozakomórkowych, wewnątrzkomórkowo, magazynowana w tkankach o intensywnym metaboliźmie - nadnercza, wątroba, soczewka oka

kwa askorbinowy wydalany jest z

moczem i potem

zapas wit. C u człowieka wynosi

1,5-5g

skutki niedoboru wit. C pojawiają się

2-3 miesiące bez spożywania

niedobór wit.C prowadzi do

szkorbutu (gnilicy)

szorkbut

włókna kolagenowe cechuje większa wiotkość ze względu na mniejszy stopień hydroksylacji reszt proliny i lizyny w tym białku i mniejszą liczbę międzyłańcuchowych wiązań wodorowych stabilizującą jego trihelikalna strukturę - zmiany skórne, kruchość naczyń włosowatych, krwawienia dziąseł

najważniejsza właściwość biologiczna kw. askorbinowego

zdolność do odwracalnego utleniania się i redukcji

kwas askorbinowy może utleniać się do

kwasy dehydroksyaskorbinowego, staje się donorem równoważników redukujących (silnie redukujący)

redukcja kwasu dehydroksyaskorbinowego

donorem wodoru jest zredukowany glutation

wit. C wykazuje właściwości antyoksydacyjne

ze względu na zdolność do odwracalnych reakcji utleniania i redukj

właściwości antyoksydacyjne

ochrona tkanek, płynów ustrojowych przed większością reaktywnych form O2, znaczenie w oku i tkance płucnej

wit. C jest niezbędna do

utrzymania jonów metali Fe2+, Ca2+ w formie zredukowanej - prawidłowe funkcjonowanie enzymów

wit. C jest koenzymem

niektórych hydroksylaz - prolilowej, lizylowej - synteza kolagenu, dopaminy - betahydroksylaza dopaminowa, synteza amin ketocholowych i kwasów żółciowych - 7-alfahydroksy

wit. C jest ważna w procesie wchłaniania

Fe z przewodu pokarmowego (wchodzi w skład preparatów Fe)

objawy nadmiaru wit.C

nudnosci wymioty biegunka

ciemnienie enzymatyczne

odpowiada za nie oksydaza polifenolowa (tyrozynaza,katecholaza) występuje np. w wyciągu z ziemniaka. oksydaza przyjmuje e- od fenoli i przekazuje je na O2 redukując go do H2O. produktem są chinony, kondensujące do barwnych produktów

oksydaza polifenolowa jest

metaloproteinazą (zawiera Cu 2+), enzymem przenoszącym e- z substratu na O2, katalizuje utlenianie o i p-fenoli, utlenia pirokatechinę do chinonów, utlenia fenol, utlenia pirogallol - produkty różowe do ciemnobrunatnych w zależności od ilości grup fenolowych w substracie

aktywność dehydrogenazy bursztynianowej in-vitro oznacza się

wykorzystując akceptor elektronów heksocyjanożelazian III potasu. elektrony powstające w reakcji redukują żółte jony heksocyjanożelazianu III potasu absorbujące światło fali 420nm do bezbarwnego heksocyjanożelazianu

absorbancja wprost proporcjonalna do stężenia związku

zmiana absorbancji świadczy o zmianie stężenia FeCN6 3-

mianą aktywności dehydrogenazy bursztynianowej jest

stopień redukcji heksocyjanożelazianu III a więc zmniejszenie wartości absorbancji roztworu

katalaza katalizuje reakcję

rozkładu nadtlenku wodoru do wody

reakcja katalazy jest przykładem reakcji

dysproporcjonowania - jedna cząsteczka H2O2 jest utleniania a druga redukowana

uwolniony podczas reakcji katalazy tlen powoduje

szybkie pienienie roztworu

peroksydazy katalizują reakcję

utleniania różnych substratów organicznych i nieorganicznych z jednoczesną redukcją H2O2 → H2O

zasada oznaczenia w peroksydazach polega na

utlenianiu przez peroksydazę benzydyny z jednoczesnym H2O2 → H2O. powstaje niebieski produkt

produkt reakcji peroksydazy

błękit benzydynowy

w środowisku zasadowym kwas askorbinowy utlenia się do

kwasu dehydroksyasrobinowego, redukując żółty heksocyjanożelazian III potasu do bezbarnego he

obecność heksocyjanożelazianiu II potasu wykrywa się

dodając w środowisku kwaśnym jony Fe 2+co prowadzi do powstania błękitu pruskiego

kwas askorbinowy specyficznie redukuje kwas fosfomolibdenowy VII w roztworach o wartości pH

1-7

kwas askorbinowy utlenia się do kwasu dehydroaskorbinowego natomiast kwas fosfomolibdenowy ulega

redukcji do mieszaniny tlenków molibdenu - błękitu molibdenowego

w zakresie pH 1-7

żadne inne reduktory obecne w płynach ustrojowych i tkankach nie redukują odczynnika Folina

metoda folina pozwala na oznaczenie

stężenia kwasu askorbinowego 1-50 mikrogram/ml