exploration du genome part 2

quelle était le type d’étude du caryotype et quelle était sa limite principale

• pdt 50 ans c’était le seul examen qui permettait une étude globale du genome

• étude pangenomique

• limite = resolution

quelle est la révolution d’un caryotype standard

10 Mb

on peut en avoir des plus résolutifs = haute résolution

= ces caryotypes sont obtenues qd les K sont bloqués en prometaphase= aspect plus étiré = + de bandes visibles = on peut voir des anomalies de plus petites tailles jusqu’a 5Mb de résolution

dans quel cas prescrit t- on un caryotype

= constitutionnel :

• diagnostic prénatal K ( DPNC)

• en post natal = prise en charge des troubles du développement

• exploration des pathologies des troubles de la reproduction

• les enquêtes familiales

=

quels sont les différentes raison de prescrire un DPNC

on réalise des caryotypes chez le foetus pour:

• lorsqu’on voit des malformations a l’échographie signes d’appel echographique = SAE

• quand la patiente est a risque accru de trisomie 21 ( anomalie chromosomique la plus fréquente

• on recherche des anomalies de grande taille ( sup a 10Mb)

quelles méthodes peut on également utiliser lorsqu’on Recherche des anomalies ( autre que le caryotype )

• ACPA pour les anomalies K de petites tailles déséquilibrées invisible au caryotype standard

• en cas de SAE = si le caryotype est normal ou fait une ACPA

• test ADN libre circulant ( ADNc) = test de dépistage pour dépister avec une très bonne sensibilité et spécificité la trisomie 21 foetale a partir d’une simple prise de sang maternel

que peut on faire en post natal

• on peut réaliser un caryotype mais tout dépend de ce que l’on recherche (on fait un caryotype uniquement si on recherche une anomalie visible au caryotype) sinon direct ACPA

quels sont les 2 types d’exploration des pathologies des troubles de la reproduction

• fausse couches a répétition ( > 3 fausses couches = caryotypes pour rechercher translocation ou inversion)

• homme avec une spermogramme anormal = oligospermie ou azoospermie / syndrome de Klinefelter peut être chez qqn avec une azoospermie

quel type d’anomalie peut être recherché lors d’enquête familiales

• quand on trouve une anomalie chromosomique de structure , on fait un arbre généalogique et on regarde si cette anomalie est héritée ou bien au contraire si elle est de novo (= accidentelle, uniquement chez le patient).

  • Si elle est héritée, on recherche les porteurs de cette anomalie dans la famille

  • ++ utile dans le cas d’une grossesse chez un des porteurs, on sait qu’il y a un risque de transmission déséquilibrée de la translocation donc on fera un diagnostic prénatal dans ce cas.

a l’origine de quoi sera le gêne Bcr- abl

• augmentation de la prolifération cellulaire

• de la diminution de l’apoptose

• de la diminution de la réparation de l’ADN

• et donc à l' origine de la croissance tumorale.

Cette translocation se voit essentiellement dans les leucémies myéloïdes chroniques.

quelles sont les limites du caryotype ( 2)

• faible résolution ( invisible <5Mb)

• technique longue car nécessite une culture cell

dans quels cas L’ACPA ET LA FISH REMPLACE LE CARYOTYPE

• ACPA: remplace le caryotype pour la recherche d’anomalies chromosomiques déséquilibrées de petite taille

• FISH: permet de faire des diagnostic quand on recherche des anomalies de nombre des K et permet de confirmer des anomalies de structure et parfois caractériser des anomalies qu’on a vu au caryotype

= très rapide FISH !!!!

quels sont les techniques meloculaires utilisées en cytogénétique

• fondées sur l’hybridation : complémentarité des bases de l’ADN

• fondées sur la PCR

• fondées sur le séquençage haut débit ( NGS)

quels sont les techniques fondées sur l’hybridation

• FISH

• ACPA ou CGH-array

que permet la technique moléculaire fondées sur la PCR

• quantification génique : MLPA, QMF-PCR = technique de PCR semi quantitative pour évaluer le nombre de copies d’une ou plusieurs séquences d’ADN => permet de confirmer les anomalies mises en évidence a l’ACPA

quelles sont les techniques moléculaire fondées sur le séquençage haut débit

• DPNI de la trisomie 21

• prélèvements

citez des prélèvements postnatal

• prise de sang

• biopsie cutanée

citez des prélèvements prénatal

• prélèvements de villosités chorales ( PVC)

• prélèvements de liquide amniotique ( PLA)

• prélèvements de sang du coron ( cordocentese )

citez des prélèvements hémato-oncologie

• biopsie de la crete iliaque

• ponction sternale

généralité sur la fish ( des + les 2 types de fish)

• Hybridation de sondes moléculaires (petites séquences d’ADN) marquées par un fluorochrome sur un génome entier (noyaux interphasiques ou métaphases)

• FISH EN DIRECT : ( avant culture) : sur des noyaux interphasiques uniquement → résultats en 12H

• FISH APRES CULTURE : sur des métaphases

caractéristiques de la fish

• basé sur la complémentarité des bases de l’ADN ( AT/CG) et sur la dénaturation réversible de l’ADN ( thermique : rupture des liaisons H)

• resolution 100-300Kb

• sondes commerciales ou a façon ( obtenues par marquage de l’adn cloné dans différentes vecteurs )

avantages de la FISH

• rapidité 12H et faisabilité

inconvénients de la fish

• analyse ciblée donc cela nécessite de connaitre la région chromosomique a étudier , il faut savoir a l’avance ce que l’on recherche

• 3 cibles maximum par tests car on est limité a 3 fluorochromes ( sauf le caryotype multicouleur )

décrire le principe de la fish

1. Dépôt de la sonde sur la lame.

2. Incubation des lames. L’appareil chauffe pour dénaturer la sonde et la cible = codénaturation.

3. L’appareil refroidit à 37°C pour que s’établissent des liaisons hydrogène entre la sonde et l’ADN cible = hybridation ; la sonde se fixe sur la séquence d’intérêt.

4. In effectue plusieurs lavages pour éliminer l’excès de sondes libres dans le mélange (on enlève le bruit

de fond).

5. On observe, avec différents filtres adaptés aux différents fluorochromes, au microscope à

épifluorescence les sondes fixées sur leurs cibles.

• Si on observe de la fluorescence, la sonde est fixée sur la cible donc la séquence est présente.

• Si on n’observe pas de fluorescence, la séquence est absente = délétion.

quels sont les différents types de sondes de la fish

• sonde chromosome spécifique

• sonde de peinture chromosomique

• sonde locus spécifique

Décrire les caractéristiques la sonde chromosome spécifique:

• elle permet de compter le nombre de K sur des noyaux interphasiques ou de métaphases

• sur noyaux application aux :

• cell des villosités choriales

• amniocytes

• lymphocytes

• cell epithelial buccales

• spermatozoïdes

• coupes histologiques

décrire la sonde de peinture chromosomique

caractériser/confirmer un remaniement de structure sur des K métaphysiques uniquement → ces sondes peignent entièrement les K d’une paire chromosomique

décrire la sonde locus spécifique

• diagnostiquer un microremaniement sur des noyaux interphasiques ou des métaphases

caractéristiques et utilité du caryotype multi couleur ou M-FISH

• identifier des K marques surnuméraires et des K dérivés de translocation

• resolution = 10Mb

• pangenomique : on peut observer l’ensemble du genome

• très cher

• on utilise 5 fluorochromes différents qui vont pouvoir être coupler on les utilise soit seul soit on va en coupler 2 ou 3 différents. Grâce à ceci, on obtient une couleur différente pour chaque paire chromosomique

• Ce caryotype multi-couleur se fait uniquement après culture donc sur métaphases. Il permet de caractériser ou de confirmer des anomalies de structure qu’on aurait du mal à caractériser sur un simple caryotype standard.

caractéristiques du banding multi couleur

• Principe du caryotype multi-couleur appliqué à une paire chromosomique
  - En couplant plusieurs fluorochromes tout le long d’un chromosome, on fait apparaître des bandes de couleur

  différente
  - Caractériser un remaniement de structure intra-chromosomique (inversion +++)

citez des exemples d’applications de la FISH

• confirmation / caractérisation d’une ano mise en évidence au caryotype ( précisions points de cassure)

• confirmation d’une anomalie mise en évidence a l’ACPA ( sinon la confirmation se fait par QMF-PCR)

• recherche d’ano ( microdeletion microduplications)MAIS IL FAUT SAVOIR CE QU’ON RECHERCHE A L’AVANCE

• en prenatal +++( detect aneuploïdie en cas de signes d’appel d’échographie

• Recherche/estimation d’une anomalie chromosomique en mosaïque (sur noyaux) (sur un caryotype, on analyse et on compte 15 à 20 métaphases et donc on peut passer à côté d’une anomalie en mosaïque à faible pourcentage alors que quand on fait de la FISH, on peut regarder 200 à 300 noyaux beaucoup plus facilement)

  • DPI : lorsqu’un des parents est porteur d’une translocation, on peut faire un DPI sur des blastomères que l’on prélève au niveau de l’embryon et on va pouvoir analyser par FISH ces blastomères et ne réimplanter que ceux qui seront équilibrés.

  En pathologie acquise :

  - Recherche de maladie résiduelle/suivi de traitement (plus sensible que le caryotype)

Par quoi est causé le syndrome de williams-Beuren et quels sont les csq

• microdeletion du 7q11.2 = microdeletion de 1,5Mb sur le bras long du K7 touchant notamment le gène de l’élastine=> provoque une maladie génomique car plusieurs gènes sont touches

• Dysmorphie faciale caractéristique et comportementale

Quel est l’intérêt et le but de faire un fish en direct sur noyaux interphasiques en pré natal

Intérêt : rapidité +++ ( <12h) car pas de culture préalable dite direct, souvent des le lendemain

But : IMG plus précoce si les parents sont demandeurs

C’est quoi le kit aneuvysion

• fish en direct sur PVC ou PLA

• Au moins 100 noyaux interphasiques analyses

• 5 sondes différentes

• Le kit comprends des sondes centromeriques des KX ( centromère en vert) et des KY ( centromère en rouge) et K18 ( centro bleu) + des sondes de locus spécifiques pour K13 et ké1 sur le bras long