18.3: RNA processing en turnover

slide dogma

tabel met functies RNA’s

grootste deel van totale cellulaire RNA

rRNA (70-80%)

aantal verschillende rRNA’s bij bacteriën en eukarya

• bact: 3 verschillende rRNA

• euk: 4 verschillende rRNA

welke ribosomale subeenheden bij pro- en eukaryoten

• Bacteriën: 70S

  • Grote subeenheid: 50S

    • 23S

    • 5S

  • Kleine subeenheid: 30S

    • 16S

• Eukarya: 80S

  • Grote subeenheid: 60S

    • 28S

    • 5.8S

    • 5S

  • Kleine subeenheid: 40S

    • 18S

Wat betekent die S

Svedberg, sedimentatie coëfficiënt

→ zwaardere partikels sedimenteren eerst en dan de andere.

Ze sedimenteren volgens de sedimentatiecoëfficiënt (gecorreleerd met de massa, vorm en massadichtheid van het partikel)

waar vind eukaryotische rRNA synthese plaats

nucleolus

waaruit bestaat de nucleolus en wat deon alle eenheden

fibrillen en granulen zonder membraan

• fibril: transcriptie rRNA en pre-rRNA processing

• granulen: pre-ribosomale subeenheden vormen

wat zie je hier

Gelijktijtide synthese van meerdere transcripten waardoor je een borstelvormige structuur krijgt.

We krijgen pre-RNP’s: pre-ribonulceoproteïne complex

Dit doordat de verschillende kopieën van RNA genen in tandem liggen, het aantal kopiën is verschillend tussen species

Er liggen ook niet afgeschreven spacers tussen de transcriptie eenheden

hoe liggen de promotoren van de rRNA genen tov elkaar

A, in dezelfde richting

wat zijn NOR’s

nucleolus organisator regio’s → DNA regio dat rRNA genen bevat dei in tandem liggen en gelegen id i de nucleolus

liggen alle NORs op zelfde chromosoom

hoeveel bij mens

meerdere kunnen op verschillende chromosomen liggen

bij mens 5 (dus in tot 10 door diploïd)

wat met nucleolus tijdens mitose

verdwijnt

blijft nucleolus hele tijd zelfde grote

nee, grootte corrreleert met activiteit

als hoge snelheid van proteinsynthese hebben we veel ribosomen nodig en kan to t25% van nucleair volume innemen.

hoe gebeurt pre-rRNA processing bij eukarya

• in de nucleolus:

  • de transcriptie-eenheden worden afgeschreven door RNA pol I: pre'-rrNA wordt gevormd

  • pre-rRNA processing:

    • de spacer stukken uitknippen en afbreken

    • dit geldt voor 18S, 28S, 5.8S rRNA

• iet in nucleolus: 5S rRNA (behoort niet tot de NOR’s)

  • weinig tot geen processing

  • afgeschreven door RNA pol III

Hoe is de pre-rRNA processing geregeld

• snoRNA: small nucleolar RNA: korte noncoding RNA hoofdzakelijk in nucleolus

  • ze binden aan complementaire regio’s in pre-rRNA en coördineren de pre-rRNA processing bv bepalen plaatsen van methylering en knipping

• Methyleringen: op 2’ OH van ribose

hoe bepaalt snoRNA de plaats van methylering

Bepaalde snoRNA’s vormen snoRNP’s die een RNA methyltransferase bevatten, zo wordt het pre-rRNA gemethyleerd

rol van de verschillende eukaryotische RNA polymerase in rRNA en ribosomen maken

• RNA pol I: pre-rRNAA na processing: 18S, 5.8S, 28S rRNA

RNA pol II:

• synthese van pre-mRNAs, na processing mRNA export naar cytosol → translatie in eiwitten (RPL en RPS: ribosomale proteins, large en small)

• synhtese snoRNA

RNA pol III: 5S RNA

In de nucleolus krijgen we dan de assemblage van pre-ribosomale eenheden → import van de RPs op rrNAs tvv de (pre)ribosomale eenheden

slide centrale dogma

in welke 4 stappen verloopt pre-tRNA processing

bij welke organismen verloopt dit

Bij eu en prokarya

• Leidersequentie wordt verwijderd aan 5’ kant

• nucleotiden aan 3’ verwijderen en CCA toevoegen

• Chelmische modificatie van de basen:

  • methyleringen van basen (bv methylcytosine)

  • methyleringen van ribose

  • dealinering van A geeft iosine (I) → reactie gekatalyseerd door adenosine deaminase

• soms gebeurt er splicing: verwijderen van een RNA intron (door RNA endonuclease en dan ligase)

komt inosine ook voor in ds DNA

nee, wordt verwijderd door BER

bij pre-tRNA processing komt soms splicing voor, was dit ook bij rRNA

nee, de non transcrubed dingen werden weggedaan, maar werden niet terug aan elkaar gedaan

Hoe gebert pre-mRNA processing bij eukarya en prokarya

• pro

  • geen processing (mRNA wordt gemaakt en meteen door ribosomen vertaald), tijdens de transcriptie kan al translatie gebeuren (polyribosoom)

  • polycicstronische mRNAs (draagt code voor meerdere eiwitten)

  • geen celkern

  • co-transcriptionele translatie

• Eu: pre-mRNA processing is een co- en post-transcriptioneel proes en omvat

  • 5’ capping

  • pre-mRNA splicing

  • 3’ polyadenylering

  • RNA editing

Hoe gebeurt 5’ capping van pre-mRNA en wat is de functie ervan

Nadat de initiatie is gestart wordt een 7-methylguanosine covalent gebonden aan uiteinde

Soms is er ook een methylering van de ribose van het 1e en 2e nt

RNA pol kan de novo starten en dys heeft het eerste nucleotide 3 fosfate hangen aan uiteinde, deze worden dan neit aan de 3’ OH van 7-methylguanosine gebonden, maar aan de 5’ waardoor je een 5’-5’ binding hebt ipv een 3’-5’ zoals normaal

• Functie: stabiliteit bieden en beschermen tegen exonucleasen

• belangrijk voor binding ribosoom omdat deze de 5’ capping gebruikt om mRNA te herkennen

wanneer start 5’ capping

vanaf transcriptie start en je een vrij 5’ uiteinde hebt

hoe gebeurt 3’ polyadenylering en wat is de functie

• polyadenylatie plaatst tussen AAUAAA seq een G/U seq (GU-rijke en / of U)rijke sequentie)

• knipping 10-35 nt stroomafwaarts van AAUAAA seq

• toevoeging poly-A-staart door poly(A)polymerase (zonder template) en gebruikt ATP

• 3’ processing leid ook tot terminatie transcriptie (RNA pol II dissocieert)

• uitzonderingen: transcripten zonder polyAstaart (zoals mRNA van histonen)

• Functie

  • beschermen tegen exonucleasen

  • betrokken bij export mRNA uit kern naar cytoplasma

  • betrokken bij initiatie van trasnlatie

wat zijn introns

seqenties aanwezig in eerste transcript, maar niet na processing

hoe gebeurt pre-mRNA splicing

er wordt een hetroduplex gevormd: DNA:RNA hybride

R-looping techniek: het RNA hybridiseert met de matrijs streng, er wordt een complex gevorm van 2DNA en 1RNA strengen

functie spliceosomen

verwijderen van introns en samenvoegen van de exonen

weetje!

15% van de erfelijke aandeoningen zijn fouten in slpicing van pre-mRNA

wat zijn exonen

sequenties die overblijven en aanwezig zijn in matuur RNA

wanneer vidnt splicing plaats

tijdens de transcriptie en ook nog wat erna

voorbeeld van een splicing-related aandoening

Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS)

Waaruit bestaan spliceosomen

Groot complex bestaande uit RNA en eiwitten = RNP (ribonucleoprotein) complex

5snRNA’s (small nuclear RNA’s) (U1/U2/U4/U5/U6) + >200 eiwitten

hoe gebeurt assemblage van spliceosoom

• Consesus sequenties op intron: 5’ GU en 3’ AG → splicing plaatsen

• er is op het intron ook een branch point seq

• Opeenvolgende binding van snRNP’s op pre-MRNA

  • U1 snRNP bindt aan 5’ splice site (GU)

  • U2 snRNP bindt aan branch point

  • U4/U6 en U5 binden op U1 en U2 snRNP’s

• knipping van 5’ splice site

• 5’ uiteinde (net geknipt) bidnt aan 2’OH van A van branch point seq = lariat

• knipping 3’ splice site

• samenvoegen 2 uiteinden van exon

• overgang van exon 1 naar 2 wordt gemarkeerd (exon boundary) → EJC bindt

• uitgeknipte intronen worden afgebroken

slide erna

wat zijn exon junction complexen

Multiproteine complex bindt op elk nieuw gevormde exon-exon verbiding

heeft een rol bij

• non-sense gemedieerde mRNA afbraak (NMD)

• mRNA export → EJC complex bindt nucleaire export factor 1 (NXF1) → export door kernporie

• mRNA lokalisatie

• mRNA translatie

Wat gebeurt er bij progeria

• Normaal:

lamine A eiwit gevormd → wordt gefarnesyleerd (signaal om naar nucleaire membraan te gaan) → wordt dan afgeknipt

• Bij progeria:

Puntmutatie in lamine A gen → 50 AZ’en verwijderd

De ferneslyering treedt nog op → knippen gebeurt niet meer omdat de knippplats voor het protease in de 50 AZ’en aanwezig waren. D>oordat het niet geknipt wordt, blijft het aanwezig in de nucleaire membraan en krijg je daar geen mooie vezels.

Het lamine A gen heeft 12 exonen en 11 intronen

Door de puntmutatie in exon 11 wordt er een alternatieve 5’ splice site gegenereerd waardoor 150nt (zijn dus 50 AZ’en) worden verwijderd

op welke manieren kan alterntieve splicing gebeure

• skipped exon: een exon wordt mee verwijderd

• alternatieve 5’ slice site: kan resulteren in een groter of kleiner mRNA

• alternatieve 3’ splice site: verandert lenge mRNA

• retained intron: een intron wordt behouden

• mutually exclusive exons: 2 soorten mRNAs mogelijk omdat er 2 exonen zijn die nooit samen voorkomen

waardoor worden GU-AG introns herkend

GU-AG spliceosoom

waardoor worden AU-AC introns herkend

AU-AC spliceosoom

wat zijn self splicing introns

waar komt het voor

knippen zichzelf uit RNA zonder eiwitten

het RNA werkt als een enzyme → ribozyme

Komt voor in mitochondiren (gist / pplanten en sommige bacterien)

wat zijn splicing enhancers en silencers

Stukjes RNA waar eiwittten of snoRNA omsplicing aan/uit ze zetten en regelen zo pre-mRNA splicing

wat gebeurt er met de introns na splicing

meestal afgebroken, soms vorming van een functioneel product zoals een RNA (bv een sno RNA) of helpen ze bij evolutie (bv via exon shuffling of exon duplicatie)

waar start de translatie en waar stopt

startcodon: AUG

stop aan stopcodon

slide bordschema

Wat is exon shuffling

Genetische reconminatie (uitwisselong van DNA) tussen de intronen van 2 verschillende genen leidt tot genen met nieuwe combos van exonen, gekend als exon shuffling

Bv homologe recombinatie tussen retrotransposons die gelegen zijn in intronen van twee verschillende genen

wat zijn Alu sequenties

retrotransposons (SINEs) en het zijn repeats

Wat is exon duplicatie

genetische recombinatie tussen de intronen van twee homologe genen leidt tot genen met een exon duplicatie

bv homologe recombinatie tussen retrotransposon die gelegn zijn in een intron van homologe chromosomen die verkeerd zijn gealigneerd

Welke subnucleaire structuren in de celkern

• Nucleolus + verschillende andere kleine structuren, zonder membraan

• Belangrijk voor processing en verdere afhandeling van RNA in de kern

• bv

  • Cajal bodies: rol in processing (maturatie) van snoRNA en snRNA

  • Nucleaire spleckles = interchromatin granule clusters: rijk aan RNA’s, pre-mRNA splicing factors/snRNPs en niet-snRNPs splicing factor, stockage plaats, dynamisch, heeft een rol in pre-mRNA splicing

Wat gebeurt er bij RNA editing

• Co- en posttranslationele veranderingen binnenin de sequentie van (pre)mRNA of tRNA of microRNA

  • inserties en deleties van 1nt of >100 nt

  • chemische modificaties bv deaminatie

• veranderingen zijn niet aanwezig in DNA (zoals bij polyAstaart)

• veranderingen kan ORF (open reading frame) / kan een start of stop codon genereren

  • vb1: deaminatie van adenine in inosine in tRNA, microRNA en mRNA door adenosine deaminase

  • vb2: deaminatie van cytidine in uridine in mRNA van human apolipoportein B → APOB gen) door cytidine deaminase

  • vb3: insertie editing in mitochondriaal (pre)mRNA van trypanosome

functie APOB

belangrijke rol transport vetten in bloed

hoe gebeurt de cytidine deaminase in humaan APOB gen

hoe gebeurt isnertie RNA editing bij Trypanosoma

Trypanosoom:

• Eiwit-coderend gen (mitochondriaal coxII gen)

• gRNA-coderend gen (mitochondriaal gRNA gen)

Het gen zorgt voor aanmaak van een onberwerkt mRNA.

Een gRNA wordt ook aangemaakt en bindt eraan.

Waar ze niet op elkaar passen weet de cel dat hij dingen (bv U) moet toevoegen.

Enzymen zullen het mRNA knippen → voegen juiste dingen toe → plakken mRNA weer aan elkaar.

→ gRNA dient voor mRNA te editen en gRNA is reverse complement aan het finaal matuur mRNA.

slide bordschema

Hoe wordt ervoor gezorgd dat pre-mRNA processing een co- en posttranscriptioneel proces is

• enzyme vertanwoordelijk voor de capping bindt op CTD domein van RNA pol II en zorgt dat RNA dat gemaakt wordt meteen wordt gecapt.

• Door verandering van de fosforyleringcode van RNA pol II wordt spliceosoom gerecruteerd

• dan worden ook polyadenylering (voor 3’ staart) en andere factoren gerecruteerd

→ RNA pol II is een integratieplatform

Wat is DNA editing

Een DNA-editing enzyme (bv deoxycytidine deaminase APOBEC3G = deamineert cytosine naar uracil in ssDNA).

Zo is APOBEC3G een antivirale factor: HIV komt in de cel en er wordt een ssDNA gevormd complementair aan het virale RNA (reverse transcriptase activiteit) → APOBEC3G herkent ssDNA en zorgt voor mutaties → replicaite van virus wordt teniet gedaan → genoom van virus is verandert

Wat is halfwaarde tijd van mRNA en hoveel bedraagt het

Tijd die nodig is om 50% van dat mRNA af te breken: <30min - 10 uur

• prokaryoten: enkele minuten

• eukarya: uren-dagen

hoe halfwaardetijd RNA meten

Pulse-chase experimanten: radioactief maken door NTP, radioactief NTP voor half uur aan cel toevoegen endan wegnemen en kijken hoelang duurt voordat radioactiviteit voor helft weg is

wat te gebeuren met halfwaardetijd bij mRNA vaccins

voor mRNA vaccins dus halfwaardetijd verlengen (stabieler maken)

verschil is stabiliteit mRNA en rRNA/tRNA

• mRNA: hoge turnover → worden gemaakt en weer afgebroken

• rRNA en tRNA zijn meer stabiel

wat bepaalt levensduur mRNA

oa door lengte polyAstaart (want beschermt tegen exonucleasen) en aantal AU-rijke elementen in 3’UTR

amplificatie van mRNA en rRNA / tRNA

• DNA-mRNA-eiwit: sterke amplificatie (meestal 2 genen voldoende) → een gen geeft meerdere mRNA’s en mRNA geeft meerdere eiwitten

• DNA-rRNA/tRNA: minder amplificatie → RNA is het eindproduct, er zijn bv meerdere kopieën van de rRNA genen

waar vinden we fibroïne terug

in zijde

De autoimmuun ziekte ‘systemic lupus erythematosus ‘kan ontstaan
als het immuunsysteem van de patiënt zijn snRNPs aanvalt. Waarom
leidt de uitschakeling van deze complexen tot ernstige effecten?

snRNPs; small nuclear ribonucleoproteins zijn essentieel voor correcte splicing, ze
vormen samen een spliceosoom.
Minder snRNPs: splicing loopt mis, introns blijven behouden, dus groot effect op
het ORF: resulteert dikwijls in verkeerde eiwitten (verkeerde aminozuren worden
toegevoegd aan een eiwit of ook vroegtijdige stopcodons, waardoor het mRNA al
dan niet wordt afgebroken (NMD)