Biochemia 10 - RT-PCR

RT-PCR

Metoda łańcuchowej reakcji polimerazy poprzedzona odwrotną transkrypcją

RT-PCR używana jest najczęściej do

badania ekspresji genów

Bezpośrednim i najbardziej miarodajnym sposobem sprawdzenia, czy gen ulega ekspresji w danej komórce jest

wykrycie obecności transkryptu danego genu – cząsteczek mRNA.

Technika RT-PCR składa się z:

- reakcji odwrotnej transkrypcji, w której mRNA przepisywany jest na komplementarny DNA (cDNA),

- amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cDNA metodą PCR.

elektroforezę produktów (amplifikatów) reakcji PCR najczęściej w żelu agarozowym wykonuje się w celu

oceny ekspresji genu

Preparat uznaje się za czysty wówczas, kiedy stosunek A260/A280 dla RNA jest

równy lub zbliżony do 2.0

RT

odwrotna transkryptaza

dNTP

deoksyrybonukleozydotrifosforan

Etapy odwrotnej transkrypcji.

1. wstępna denaturacja 65ºC 5

2. odwrotna transkrypcja 37ºC 60

3. przerwanie reakcji 95ºC 5

4. koniec reakcji 4ºC

startery

krótkie sekwencje nukleotydowe komplementarne do początku i końca powielanego odcinka cDNA

(jony magnezu są ________ dla polimerazy Taq

kofaktorami

Przebieg reakcji PCR.

• wstępna denaturacja 94ºC 3

• denaturacja 94ºC 1

• hybrydyzacja <temperatura zależy od sekwencji starterów> 1

• wydłużanie 72ºC 2

• końcowe wydłużanie 72ºC 10

• koniec reakcji 4ºC

Rozdzielone elektroforetycznie produkty PCR wizualizujemy przy użyciu

Bromku etydyny

bufor TAE składa się z

Tris-kwas octowy, EDTA

Rozdział elektroforetyczny ile minut jakie napięcie

30 min, 100V