PCR - gensekvenseringsmetoder

PCR, sangersekvensering, pyrosekvensering, taqmanpolymeras realtidgentyping och proteinelektrofores.

Vilka 4 element behövs för att göra PCR?

Vilka 4 element behövs för att göra PCR?

• DNA

• 2 stycken DNA-primers: syntes av komplementära DNA-strängar

• DNA-polymeras (Taq-polymeras)

• Lösning med nukleotider dNTP’s (trifosfat-deoxiribosnukleotider)

• Magnesium (kofaktor)

Vilka 4 steg består PCR-metoden av?

1. Denaturering

2. Annealing

3. Extension

4. Elektrofores

Vad sker vid denatureringen?

Lösningen värms upp till en temperatur på 94 grader för att bryta vätebindingarna och separera DNA-strängarna.

Vad sker vi annealing?

Lösningen kyls till en temperatur på 55 grader. Detta tillåter DNA-primas att binda till de individuella strängarna av DNA.

Sedan kan Taq polymeras binda in vid 74 grader. Nukleotiderna i lösningen ( dNTP) kommer att bygga en komplementär sträng till de enskilda strängarna.

Vilka typer av primers tillsätts?

Reverse primer: binder till sense

Forward primer: binder till anti-sense

Hur lång blir de nysyntetiserade strängarna?

De blir lika långa som primerns + sekvens fram till nästa primer.

Hur många gånger upprepas denna process?

35 gånger.

Vad är skillnaden på in vivo och in vitro?

In vivo → I levande organism.

In vitro → I provrör.

Hur skiljer sig replikation in vivo och in vitro?

• In vivo används RNA-primer medan två olika DNA-primer används in vitro (PCR) eftersom de kan syntetiseras och håller längre.

• Endast ett DNA-polymeras finns: Taq polymeras.

• Här tillsäts dNTP (Adenintrifosfat, cytosintrifosfat osv).

Varför finns DNA primers i överskott?

Eftersom de förbrukas.

Vad har magnesium för roll i PCR?

För att stabilisera processen, det katalyserar Taq-polymeraset.

Vilka 4 genomsekvenseringsmetoder finns?

• Pyrosekvensering - kända mutationer

• Sangersekvensering - kända & okända

• Realtids PCR med Taqman-polymeras -

• PCR - kända mutationer/SNP

Hur sker pyrosekvensering?

Här inkorporeras baser genom enzymatisk aktivitet och det registreras “live”:

1. Vid tillsättning v nukleotider klyvs en pyrofosfat (PPi) bort.

2. PPi reagerar med APS och blir till ATP mha enzymet sulfurylas.

3. ATP bildar med luciferin ljus med enzymet luciferas.

4. Ett pyroprogram detekteras inkorporationen.

Vad är apyras?

Ett enzym som degraderar överblivet ATP.

När används pyrosekvensering och varför?

Vid genotypning av en känd mutation vid en känd plats eftersom det endast går att sekvensera ca 300 baspar.

Beskriv kortfattat hur PCR går till.

1. DNA extraheras.

2. Amplifiering av en en bit av en gen.

3. Agarosgel för att se att PCR har fungerat.

4. Restriktionsenzym klipper.

5. Agarosgel för att separera fragment.

6. UV-ljus för att detektera.

Vad är sangersekvensering och när bör det användas?

Det kan sekvensera enstaka gener eller delar av gener, upp til ca 1000 bp. Det används till:

• Kända mutationer/polymorfismer

• Sekvensering för att “leta” efter mutationer

Hur går sangersekvensering till?

1. Fluroesencemärkta dideoxynukleotider samt vanliga nukleotider inkorporeras.

2. Det används endast en primer.

3. Amplifiering sker tills en dideoxynukleotid inkorporeras eftersom de saknar ett syre → ingen fosfodiesterbinding kan skapas.

4. Det blir en kedjetermineringsreaktion.

5. Olika fragment bildas slumpmässigt.

6. Kapillärelektrofores används för att separera de olika fragmenten.

Vad är skillnad mellan PCR och sangersekvensering?

• Det används 2 primers vid PCR istället för 1

• Vid sangersekvensering tillsätts även dideoxynukleotider

• Kapillärelektrofores vid sangersekvensering är mer spesifik.

(bilden visar sangersekvensering resultat)

Hur tolkar man resultaten från sangersekvensering?

Fragmenten separeras på polyakrylamidgel.

Den kortaste kedjan är den första basen i sekvensen osv (se bild).

Vad är realtids-PCR-genotypning med Taqman?

Metoden kan endast användas för kända mutationer/polymorfismer. Här krävs två primers men även två prober.

Vad är en prob och dess funktion?

Primerns funktion är att förlänga DNA:t. Proben har en annan funktion:

→ Det är en nukleotid med en reporter (r) och en quench (Q).

→ Reporten är märkt med fluoresens (ljus).

→ De två proberna passar till de två typerna av allelerna. En till vildtypsallelen och en till den muterade.

Hur går realtids-PCR-genotyping Taqman till?

• Intakt prob: quenchern släcker ut reportern →inget ljus → ingen match. Inget av proben inkorporeras.

• Splittrad prob: quenchen släcker inte ljuset från reporten → ljus → match. En liten del av proben inkorporeras.

Hur många primers tillsätts här?

2 stycken, en reverse och en forward.

Forward: Binder till 3’→ 5’ sträng.

Reverse: Binder till 5’→ 3’sträng.

Hur tolkas resultatet av taqman realtid pcr?

Varje nukleotid med en prob har ett visst ljus.

För heterozygoter: båda färger.

För homozygoter polymorf: en färg.

För homozygot vildtyp: en färg.

Varför kör man inte proteiner på PCR?

Eftersom proteiner har olika laddningar inom strukturen kommer de att vandra till plus och minuspoolen. Istället används proteinelektrofores.

Vad är proteinelektrofores?

Proteiner separeras i ett elektriskt fält.

SDS-page tillsätts samtidigt som proteinet denatureras genom uppvärmning. De kommer att binda till proteinet proportionellt mot dess molekylmassa.

SDS kommer att göra proteinerna helt negativa.

Vad tar bort disulfidbryggor vid SDS-page?

DTT reducerar disulfidbryggor.

Hur gör man proteinelektrofores steg för steg?

1. Gel av polyakrylamid.

2. Tillsätt SDS, DTT och buffert.

3. Värm till 100 grader i 5 min.

4. Applicera i brunnar i gelen.

Hur tolkas resultat av proteinelektrofores?

Ett band motsvarar ett protein av en storlek, eller flera olika proteiner av samma storlek.

Hur detekteras resultat i olika metoder?

PCR: UV-ljus detekterar fluorescerande färg i DNA:t.

Sanger: Kapillärfores på polyakrylamidgel. Varje ddNTP märks med en fluorescerande färg som detekteras med laser.

Pyro: Ljus detekterar inkorporation.

Taq-man: Reporter märks med färg som detekteras i ett detektor.