20.2: Regeling van genexpressie in eukaryoten: genomische controle (1e niveau)

slide genexpresiie

op welke 5 niveaus regeling genexpressie bi eukaryoten

• genomische controle

• Transcriptionele controle

• RNA processing en RNA export

• Translationele controle

• Post-translationele controle

De verschillende celtypes hebben een verschillend genoom in ons lichaam

fout hetzelfde genoom

hoe kunnen we aantonen dat de verschillende celtypes hetzelfde genoom hebben in ons lchaam

• reproductief klonen

• therapeutisch klonen

wat is transcriptoom

geheel van RNAs in de cel

wat is proteoom

geheel van eiwitten in de cel

zijn proteoom en transcriptoom ook voooor alle celtypen hetzelfde

nee

wat is het verschil tussen pluri en multi potent

• pluripotent: kunnen alle celtypen vormen

• multipotent: kunnen bepaalde celtypes vormen, maar niet allemaal

zijn embryonale stamcellen pluri- of multipotent, en adulte stamcellen

embryo: pluri

adulte: multi

wat is totipotent en vb

in staat om een volledig organisme te vormen (ook verantwoordelijk voor ontwikkeling van extra-embyronaal weefsel (bv placenta))

bv zygote

wat is een blastocyst

64-cellig stadium van embryo

wat is reproductief klonen

Vorming van een nieuw organisme dat genetisch identiek is - voor het nucleair DNA - aan de somatische cel waaruit de kern is genomen

(dus niet mitochondriaal DNA)

vn waar is mitochondriaal DNA afkomstig bij klonen en nucleair DNA

kernloze eicel

nucl van lichaamscel

foto wortel

nieuwe wortel gemaakt genetisch identiek aan oorspronkelijke wortel

wat is SCNT

somatic cell nuclear transfer: een kern van een gedifferentieerde somatische cel wordt ingeplant in een kernloze eicel en een volledig nieuw organisme wordt gevormd.

Het nieuw organisme is genetische identiek -voor het nucleaire DNA - aan het organisme waarvan de kern is genomen.

Het mitochondriaal DNA is verschillend.

wat is dolly en hoe ontstaan

Ontstaan door reproductief klonen

• Uiercel van schaap nemen

• uiercel kwam in G0 fase door weinig voedsel in petrischaal

• eicel van 2e schaap nemen en nucleus verwijderen

• fusie van kernloze eicel en uiercel → diploïde cel

• Mitose stimulerende dingen toevoegen

• morula gevormd (stadium voor blastocyst)

• blastocyst wordt ingebracht in ene pseudodrachtig schaap behandeld hormonen zodat blastocyst kan nestelen in baarmoeder

• schaap gemaakt genetisch identiek aan schaap 1

wat is epigenetische reprogrammering

de nucleotidensequenties van het DNA veranderen niet, maar de epigenetische info wel (= modificaties in DNA, niet op nucleotidenniveau bv histonmodificaties, methyleringen…)

slide dolly

slide artikels

slide klonen

wat is therapeutisch klonen

aanmaak van genetisch identieke cellen die dan de beschadigde cellen kunnen vervangen. Afhankelijk van de gebruikte techniek zijn de cellen genetisch identiek enkel voor nucleair DNA (SCNT) of voor nucleair en mitochondriaal DNA (iPS)

wat is een ethische kwestie bij therapeutisch klonen

we werken met een blastocyst stadium en als we dat zouden inplanten in een baarmoeder, zou dit een embryo vormen en kunnen ontwikkelen tot een individu

Hoe werkt iPS (induced pluripotente stamcellen)

Embryonale stamcellen rechtstreeks oogsten uit blastocyst om te differentiëren.

Een gedifferentieerde cel wordt behandeld met virale partikels, deze bevatten DNA om 4 eiwitten tot expressie te brengen.

De 4 eiwitten zijn in staat de gedifferentieerde cel te dedifferentiëren en weer pluripotent te maken (zorgen voor een herprogrammering)

De eiwitten zijn niet nodig voor initiatie, maar gaan wel transcriptie regelen (ze bepalen mee welke genen tot expressie komen en welke niet)

twee manieren om aan therapeutisch klonen te doen

welke heeft een voordeel tov de andere en welk is dat dan

SCNT

iPS (geen embryo nodig)

leg dat muizenmodel met sikkelcelanemie uit

• muis met sikkelcelanemie

• huidcellen van de muis

• de huidcellen reprogrammeren door die 4 eiwitten tot expressie te laten brengen (via virussen omdat we die nodig hebben om het DNA in de cel binnen te krijgen om dan de eiwitten aan te maken)

• we krijgen iPS (pluripotent)

• cellen corrigeren voor mutatie van sikkelcelanemie (bv CRISPR Cas9)

• injectie in muis

• sikkelcelanemie opgelost

slide tabel

• diabetes type I: defecte pancreascellen vervangen om weer insuline te maken

• heart disease

• Parkinson’s disease: zenuwcellen waarvoor men probeert een oplossing te vinden

op welke manier kunnen we uitzonderingen van ‘genomic equivalence’ hebben in zeer specifieke celtypes

• genamplificaties (bv kankercel) en gendeleties (bv RBC)

• DNA rearrangements in B-lymfocyten

waarom genamplificatie in kankercellen

abnormale amplificatie van genen die groei en delen stimuleren

waarom gendeletie bij RBC

verliezen hun celkern indien voldoende hemoglobine mRNA aanwezig is

waardoor worden antilichamen aangemaakt

B-lymfocyten

Hoe ziet een antilichaam eruit

hoe wordt de deversiteit in antilichamen gecreëerd

• 2 zware ketens en 2 lichte ketens

• Diversiteit:

1) Door DNA herschikking in de varibale segmenten van het antilichaam-gen tijdens de ontwikkeling van B-lymfocyte

• DNA sigmenten voor zware keten:

  • variabel segment: V(200), D(>20) en J(6)

  • constant segment: C

  • combinatorische controle: >24.000 varianten

• gelijkaardig systeem voor lichte keten (eigen V, J en C segmenten, geen D)

2) Verhoogd aantal mutaties in de variabele gedeelten bij de proliferatie van B-lymfocyten (we willen dus net wel mutaties omdat dit de variabiliteit vergroot)

• ecpressie van een activation-induced cytidine deaminase (AID) in geactiveerde B-lymfocyten

• BER met fout-gevoelig (error-prone) DNA polymerase (wordt uitgevoerd met de bedoeling fouten toe te laten)

waarvoor staan de V, J, D en C

• v: variabel

• d: diversity

• j: join

• c: constant

Hoe gebeuren DNA herschikkingen

• Tijdens ontwikkeling van de b-lymfocyt: 2 knippingen en het stuk ertussen (D en J segmenten) worden verwijderd

• nog eens 2 knippingen die het stuk ertussen (V en D segmenten) wordt verwijderd

• Het systeem zorgt ervoor dat in het lymfocyt DNA de D en J naast elkaar liggen en de V en D ook.

• Promotor activeert om pre-mRNA te vormen

• RNA splicing zal de sequenties verwijderen die de VDJ segmenten scheiden van C segment

• Alle mRNAs zullen uiteindelijk 1V, 1D,1J en 1C hebben. De C zal altijd identiek zijn en de andere verschillend tussen alle B-lymfocyten.

• Elk V-segment heeft een promotor die pas geactiveerd kan worden na de DNA herschikking

• na de herschikking liggen de enhancer sequenties dichter tegen de promotor: activatie van transcriptie

waar ligt de promotor van het antilichamengen

a) stroomopwaarts van V-segment

b) stroomafwaarts van D-segment

c) stroomopwaarts van J-segment

d) stroomopwaarts van C-segment

a

komt niet constant tot expressie omdat de promotor niet acties is, hij kan pas geactiveerd worden na DNA rearrangement

is de (de)condensatiegraad van chromatine gelijk voor alle celtypes

vb

nee

• polytene chromosomen bij Drosophila

• DNAse I gevoeligheid

Wat zijn chromosomale puffs en waar komen ze vooral tot expressie

Typisch voor giant cells in Drosophila

• grote cellen die niet delen, maar wel in volume toenemen

• bv in speekselklier en darm

• herhaalde DNA replicatie zonder deling resulteert in polytene chromosomen (reuzechromosomen)

Polytene chromosomen hebben een typisch bandenpatroon: donkere strpen = sterk gecondenseerd chromatine

Puffs: gedecondenseerd chromatine, plaatsen van actieve transcriptie

Wat is Southern blot analyse en hoe doe je het

Techniek voor detectie van bepaalde DNA seq in een mengsel van DNA moleculen gebruikmakend van een ‘probe’

Probe: stukje DNA of RNA dat radioactief of fluorescent gemerkt is (bij ds probe wordt DNA eerst gedenatureerd)

Werkwijze:

• DNA mengen met een restrictie-enzyme (= enzyme dat een welbepaalde sequentie herkennen en knippen → sequentiespecifiek), het DNA wordt geknipt in fragmenten

• Agarose gelelktroforese: scheiding van de DNA moleculen oiv een elektrisch veld → volgens grootte (grote fragmenten bovenaan en kleine onderaan)

• Blotten: transfer van DNA moleculen uit de gel (vaste matrix) en deze komen op de membraan.

  • Gebeurt via capillariteit: vloeistof wordt opgezogen en gaat door de agarose gel → DNA komt op de membraan terecht

• Denatureren van de probe (als deze ds is) en labelen

• Probe toevoegen aan DNA.

• Hybridisatie stap: het membraan met het DNA wordt geïncubeerd met de probe die zal binden aan een complementaire DNA seq (= hybridiseren).

• Visualisatie stap: het DNA fragment waarop probe is gebonden wordt gevisualiseerd afhankelijk van hoe de probe gemerkt is.

leg dat ding uit van DNAse I (endonuclease) sensitieve regio’s

wat toont dit aan

Dit toont aan dat de condensatiegraad verschilt tussen verschillende celtypes

• voeg DNAse I toe aan chromatine van RBC en aan chromatine van eileider, dit knipt niet sequentie specifiek (kan enkel knippen in ‘lussen’, dus waar chromatine niet extreem is opgevouwen)

• we zullen het DNA isoleren door een protease toe te voegen om de eiwitten te verwijderen en een restrictie enyzme om het DNA te knippen

• we doen Southern Blot analyse

• we voegen bij beiden een probe voor ovalbumine, en een probe voor globine toe

• we zien dat bij RBC chromatine het singaal voor ovalbumine blijft, maar dat voor globine valt weg wanneer we DNAse I toevoegen, dit doordat RBC veel hemoglobine aanmaken en dit dus in een open structuur ligt

• bij oviduct verdwijnt globuline niet, maar ovalbumine wel, hier is globuline dus zeer sterk opgevouwen, want het moet niet tot expressie komen

hebben de verschillede celtypes eenzelfde epigenoom

nee

genetische vs epigenetische veranderingen:

• wat is het

• is het omkeerbaar

• is het overerfbaar

• voorbeeld

Genetische veranderingen:

• veranderingen in DNA seq (volgorde nucleotiden)

• nee

• overerfbaar

• veranderingen van 1nt (bv missense, nonsense, nonstop en stille mutaties), inserties of deleties van 1 of meerdere nt die tot leesraamverschuiving kunnen leiden, duplicaties, inversies en translocaties

Epigenetische veranderingen

• stabiele wijzigingen in het chromatine (DNA bezet met eiwitten) waarbij de expressie van genen verandert onafhankelijk van veranderingen in DNA sequenties

• ja

• al dan niet overerfbaar

• post-translationele modificaties van hitonen, remodelering van chromatine, DNA methylering

de verschillende celtypen in multicellulire uekaryoten hebben in het algemeen … genoom, maar een … epigenoom, transcriptoom en proteoom

zelfde

verschillend

enzymen om histonen te (de)acetyleren

histone acetyl transferase en deacetylase

enzymen om histonen te (de)methyleren

histone methyltransferasen en demethylasen

Wat zijn PRC complexen, welke zijn er en wat doen ze

Polycomb repressief complexen → PRC1 en PRC2 = proteïnecomplexen

Zorgen dat transcriptie uitgeschakeld wordt

• PRC2: methylering van histon 27 op H3

• PRC1: ubiquitinatie (= vb van een posttranslationele modificatie) van Lys 119 van H2A

→ condensatie van chromatine

→ gen wordt uitgeschakeld

wat is DNA methylatie

cov binding van een methylgroep op cytosine in DNA

Wat zijn CpG eilanden

Niet alle cytosines worden bij DNA methylatie gemethyleerd, wel de C gevolgd door een G (dus 5’-CG-3’)

de methylering van die C’s in eukaryotische promotors leid tot transcriptionele repressie

Mechanisme:

• Transcriptie factoren kunnen niet binden op de gemethyleerde DNA promotor

• er worden methyl-bindinde eiwitten (bv MeCP2) gerekruteerd en deze recruteerd histon modificerende enzymen of chromatine remodelleer factoren (bv histon deacetylasen om het nog compacter te maken)

→ celtype specifieke methylering

is DNA methylering omkeerbaar

ja

Wat is Rett syndroom

• neurodegeneratieve ziekte

• mutatie in MeCP2 gen dat op X-chromosoom ligt

• MeCP2 is een methyl CpG bindend eiwit en herkent gemethyleerd DNA en recruteerd enzymen

• Als dit eiwit niet functioneel is krijges we dus expressie van genen in de hersenen die normaal niet tot expressie zouden komen

waarom is het Rett syndroom enkel aanwezig bij vrouwen

omdat mannen XY hebben (fenotype is lethaal), dus als die dat syndroom hebben zijn die al dood voor de geboorte

Wat is het Angelman en Prader-Willi syndroom

Er is een maternale imprinting (maternaal alleel gemethyleerd) en een paternale imprinting (paternaal alleel gemethyleerd)

Imprinting op chromosoom 15: deletie geeft 2 verschillende ziektebeelden afh van welk alleel de deletie heeft

Beide syndromen zijn dus gevolg van een deletie op chromosoom 15

Groene regio: enkel op maternaal alleel gemethyleerd en is gelinkt aan meerdere genen

Paarse regio: enkel op paternaal alleel gemethyleerd en i hoofdzakelijk gelinkt aan UBE3A dat codeert voor E3 ubiquitine ligase (enzyme dat een rol speelt bij gecoördineerde afbraak van eiwitten)

ANgelman syndroom (ontwikkelingsachterstand, karakteristieke lach) -< UBE3A uitgeschakeld

• door promotor methylering paternaal alleel

• door deletie op maternaal alleel

Hierdoor stapelen eiwitten zich op

Therapie is gericht op de inductie van de expressie van het UBE3A gen

Prader Willi syndroom (lichte mentale retardatie en obesitas)

Genen die gelegen zijn in de groene regio zijn uitgeschakeld

• door promotor methylering op maternaal alleel

• door deletie op paternaal alleel

wat is X-chromosoom inactivatie

Vrouwen: 1 van de 2 X-chromosomen worden geïnactiveerd tijdens de embryonale ontwikkeling (door DNA methylatie), welke X geïnactiveerd wordt is een willekeurig proces

Er gebeurt een intensieve DNA methylering, chromatine condenseert, transcriptie stopt grotendeels

hoe wordt het geïnactiveerde X-chromosoom genoemd

Barr lichaampje

lapjeskatten kunnen mannelijk of vrouwelijk zijn

fout, kunnen enkel vrouwelijk zijn

Hoe gebeurt de inactivatie van het X-chromosoom precies

Expressie van Xist RNA in het X-chrom dat geïnactiveerd wordt

Xist RNA = lncRNA (long noncoding RNA) → geen expressie

op foto: 1 X-chrom met Xist RNA

Wat wordt bedoeld met ‘Xist RNA werkt in cis’ en hoe werkt het juist

het leidt tot inactivatie van X-chrom waar het zelf op actief is

Het ander chromosoom (dat niet geïnactiveerd is) zal geen Xist RNA tot expressie brengen, maar bevat het gen wel, de promotor is inactief

Xist RNA bedekt het X-chrom dat geïnactiveerd wordt → rekrutering van chromatine modificerende enzymen dat leidt tot stilleggen van transcriptie

Het Xist RNA wordt afgeschreven

Hoe gebeurt epigenetische overerving

na de replicatie van gemethyleerd DNA heb je hemi-gemethyleerd DNA (1 streng methyl), de nieuwe wordt gemethyleerd door DNMT1 (DNA methyltransferase 1), die herkent specifiek hemigemethyleerd DNA en methyleert de andere streng op dezelfde plek.

‘overerving’: na celdeling hebben de twee cellen hetzelfde DNA methyleringspatroon

slide tweelingen

slide effect omgevingsfactoren

slide genoom vs epigenoom

Hoe verschillen de epigenetische veranderingen (bv. DNA
methylering) van genetische veranderingen (bv. mutaties) in het DNA?

Epigenetische veranderingen zijn

• veranderingen in het epigenoom (niet in de DNA sequentie)

• omkeerbaar

• Bv. histone modificaties (bv. methylering van K27 van histone H3), DNA methylering: bv. methylering van cytosine in een CpG dinucleotide.

Genetische veranderingen zijn

• veranderingen in de DNA sequentie

• niet omkeerbaar

• Bv. veranderingen van 1 nucleotide (bv. missense, nonsense, nonstop en stille mutaties), inserties of deleties van 1 of meerder nucleotiden die tot leesraamverschuivingen kunnen leiden, duplicaties, inversies en translocaties