Gentekniker 1 - PCR och gelelektrofores

Genteknik - vad är det?

Gentekniker är i grunden metoder som man kan använda för att undersöka eller förändra (modifiera) arvsmassan. Klyvning, kloning, gelelektrofores, sekvensering, geneditering

PCR

Polymerase Chain Reaction: En molekylärbiologisk metod för att öka (amplifiera) mängden av en DNA-region i ett provrör

vad behövs för PCR?

DNA-Polymeras

DNA-templat (endast nanogram-mängder behövs)

2 korta oligonukleotider (primers)

Deoxyribonukleotider (dNTPs)

Buffert (stabilt pH, salter etc.)

Mg 2+ (stabiliserar reaktionen med positiva laddningar)

H2O

PCR-maskin

komponenterna i en PCR reaktion

DNA-polymeras: DNA-polymeraser som används vid PCR är värmetåliga och aktiva vid höga temperaturer (ofta ca 72ºC). Dessa kommer från bakterier eller arkéer som lever i exempelvis varma källor. Taq polymeras som ni använder under kursen har ingen 3'-5' exonukleas-aktivitet: ingen proof-reading (1 fel/10.000 baspar

DNA-templat: små mängder genetiskt material. Framrenat eller som del av ett mer komplext prov (t.ex. en eller flera celler) => single-cell PCR

Primers: korta, enkelsträngade, syntetiska DNA-oligonukleotider som kan baspara till utkanten av sekvensen man vill amplifiera. de framställs genom kemisk syntes. Skillnad till DNA-replikation i cellen: Primer i en PCR-reaktion består av syntetiskt DNA istället för RNA. Primern förblir en del av sekvensen.

Deoxyribonukleosid-trifosfat (dNTPs): Byggstenar till PCR-reaktionen. Används av DNA-pol.

PCR maskin: Används för att variera temperaturen i cykler under de olika stegen i amplifieringen. Väldigt exakta och snabba temperaturförändringar.

Delsteg i en PCR reaktion

1. Denaturering (95 -98 grader): separation av strängarna, skapar enkel strängat DNA templat (vätebryggorna öppnas) för att DNA-pol behöver enkelsträngad DNA som templat.

2. Annealing (45-60 grader): primers sätter sig fast på DNA strängarna, temperaturen sänks för att det ska ske. Tm = temperaturen där primern släpper fullständigt (beror på hur mycket G:C och A:T basparingar som finns mellan primer och templat)

3. Extension (72 grader): DNA-pol börjar syntetisera de nya strängerna. DNA-pol från termofila organismer har en högre optimal arbetstemperatur. Polymeriseringsriktning är 5' => 3'. dNTPs byggs in och PP frigörs.

Upprepas flera cykler. Sista cykeln avslutas med en extension => DNA förblir dubbelsträngad. Exponentiell ökning av kopieantal.

Gelelektrofores: separation och analys av DNA och RNA

DNA- och RNA-molekyler är negativt laddade pga. fosfatgruppen. Om man lägger en elektrisk spänning över gelen (Anod,+ och katod, -) vandrar nukleinsyror till anoden.

Kortare DNA-fragment tar sig snabbare igenom gelen jämfört med längre

DNA-bindande färger som syns under UV-ljus används för att synliggöra de olika DNA-fragment efter de har separerats

DNA-fragmentens storlek från olika PCR-reaktioner (2-5) jämförs med markör med kända storlekar (1)

Användningsområden för PCR och gelelektrofores

1. Amplifiera genfragment för kloning: Amplifiering av en viss DNA-sekvens följt av klyvning och ligering i en kloningsvektor. Tillåter framställning av protein för t.ex. behandling av vissa sjukdomar

2. Rättmedicinsk brottsplats utredning: Amplifiering av repetitiva DNA-regioner (så kallade Short Tandem Repeats) kan hjälpa att koppla fynd från brottsplatser till olika individer

varianter för PCR

1. Reverse Transcriptase-PCR: Används för att hitta eller kvantifiera RNA (t.ex. mRNA) i ett prov. Första steget = överföring av ett mRNA-templat till en komplementär DNA-sträng (cDNA) (= omvänd eller Reverse Transcription). I cellen används revers transkiption t.ex. för att motverka förkortning av linjära kromosomer

2. Quantitative PCR (qPCR): Används för att bestämma hur mycket av en nukleinsyra som finns. DNA:t analyseras inte på gel på slutet men amplifieringen följs under hela PCR-reaktionen.

3. Multiplex PCR: Används för att amplifiera många DNA-sekvenser samtidigt. 1 primer par per sekvens, primer är märkta för att kunna urskilja de olika sekvenserna senare

4. Droplet digital PCR: PCR i små vätskedroppar (några nanoliter per droppe) tillåter bla. exakt analys och bättre kvantifiering av små DNA-mängder