Thẻ ghi nhớ: Vi sinh | Quizlet

Bộ thuốc nhuộm Gram:

Tím gentian, DD lugol, Cồn 95°, Đỏ Safranin

Vi khuẩn Gram dương và Gram âm

Gram (+): Có 40 lớp Peptidoglycan chiếm 50% vật liệu cấu tạo TB
Gram (-): Có 1-2 lớp Peptidoglycan chiếm 5-10% vật liệu cấu tạo TB

Trực khuẩn gram âm

Nguyên tắc PP nhuộm gram

Chất cồn 95° sẽ tẩy được màu của hợp chất "Tím Gentian - iod" làm VK gram (-) trở nên không màu

Phương pháp nhuộm gram:

Nhuộm kép: Tím gentian và Đỏ Safranin

Đọc kết quả nhuộm gram

Hình dạng: cầu khuẩn/ trực khuẩn

Màu sắc: Đỏ (hồng) => Gram (-), Tím => Gram (+)

Cách sắp xếp: Trực khuẩn: thành dây, đám, đơn, đôi, riêng lẽ, Cầu khuẩn: thành chùm, chuỗi, đơn, đôi, riêng lẽ

Cầu khuẩn gram dương

Phương pháp phân lập VK:

PP cấy vạch 3 chiều và PP cấy trong ống nghiệm

Nguyên tắc, mục đích và môt trường trong phương pháp cấy vạch 3 chiều

Nguyên tắc: Làm cạn dần mầm cấy
Mục đích: Phân lập vi khuẩn
MT: NA

Đọc kết quả phương pháp cấy vạch 3 chiều

Có bao nhiêu khúm ? Chú ý về Hình dạng (đường kính, độ lớn), Màu sắc và Độ đục trong

PP nuôi trong ống nghiệm gồm mấy MT:

MT lỏng, MT thạch nghiêng, MT thạch nghiêng sâu

Phương pháp nhuộm kháng acid còn được gọi tên là:

PP nhuộm Ziehl - Neelsen

Đặc điểm cấu tạo TB trực khuẩn kháng acid

Trực khuẩn Mycobacteria có lớp sáp bên ngoài, nhuộm Carbonfuchsin lâu (5-10 phút) hoặc đun nóng thì ăn màu rất chắc và không thể tẩy màu bằng cồn - acid

Mycobacteria thường gặp:

M. tuberculosis: lao người
M. bovis: lao bò
M. leprae: phong

Bộ thuốc nhuộm kháng acid:

Carbonfuchsin, Xanh metylen, DD acid-alcol (HCl 3 %, alcol 70°)
Trong đó: DD acid-alcol tẩy màu carbonfucshin của TB biểu mô, bạch cầu và VK thường. Xanh metylen bắt màu TB biểu mô, bạch cầu

Đọc kết quả nhuộm kháng acid:

Có hoặc không có kháng acid

Đối với mẫu đàm trong PP nhuộm kháng acid cần chú ý

Quan sát 3 dòng, mỗi dòng quan sát 100 quang trường, đếm số lượng và trả lời:
1. 0 - 3 / 100 quang trường => Âm tính
2. 4 - 9 / 100 quang trường => Ghi số cụ thể
3. 10 - 99 / 100 quang trường => 1+
4. 1 - 10 / 1 quang trường => 2+
5. > 10 / 1 quang trường => 3+

Ưu và nhược điểm của PP nhuộm kháng acid:

Ưu: Dễ thực hiện, kết quả nhanh, rẻ tiền và có thể thực hiện nhiều nơi
Nhược: Độ nhạy thấp (30-40%) và 65-75% đối với nhiều mẫu bệnh phẩm.
Kết quả phụ thuộc vào số lượng VK có trong bệnh phẩm (Dương tính: >10^5 VK/1ml)

Kháng sinh đồ là gì:

Là PP tìm độ nhạy cảm của VK đối với các loại KS

Có mấy phương pháp tìm KSĐ:

PP Kirby-Bauer (Đĩa giấy khuếch tán trên thạch)
PP pha loãng liên tiếp
PP E- test

Nguyên tắc của 3 phương pháp tìm KSĐ:

Nguyên tắc Kirby-Bauer: KS được tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch chung quanh, ngăn chặn sự phát triển của VK.
Đường kính của vòng vô khuẩn mô tả độ nhạy cảm của VK đối với KS (Định tính)
Không có vòng vô khuẩn: VK kháng thuốc acid
Nguyên tắc pha loãng liên tiếp: Dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loãng KS với sự tăng trưởng của VK
Xác định được nồng độ tối thiểu (MIC) của KS ngăn chặn sự tăng trưởng của VK (Định lượng)
PP E- test: Dựa trên nguyên tắc khuếch tán có cải tiến, cho kết quả có tính định lượng

Nguyên tắc chọn lựa đĩa kháng sinh:

Đường kính 6mm
Tẩm thuốc KS có nồng độ tiêu chuẩn
Bảo quản trong ống chống ẩm < 4°C, chuẩn bị dùng 2-8°C, nhiệt độ phòng 1-2h trước dùng

Tiêu chuẩn chọn lựa kháng sinh làm KSĐ:

Chọn KS đại diện cho nhóm có phổ rộng
Tùy thuộc vào loại VK thử nghiệm
Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn
Tùy theo chiến lược và chính sách sử dụng từng nơi

Tiêu chuẩn chọn lựa MT làm KSĐ:

MT tiêu chuẩn thực hiện KSĐ là MHA
Có thể thêm 5% máu người (Streptococi), NaCl 2% (Staphylococus kháng methicillin), Ca2+ Mg2+ (độ nhạy cảm Pseudoamonas Aeruginosa với aminoglycoide)
pH = 7,2 - 7,4
h = 4mm, bảo quản trong túi plastic - tủ lạnh, không dùng sau 7 ngày, đạt nhiệt độ phòng khi dùng

Tiêu chuẩn chọn làm VK kiểm chứng thực hiện KSĐ:

Dòng VK chưa hề có biểu hiện kháng thuốc đối với tất cả các loại thuốc KS được dùng để kiểm tra chất lượng MT và loại đĩa KS đang sử dụng trong thực nghiệm nhạy cảm KS
Thông thường:
Escherichia coli ATCC 25923
Staphylococcus aureus ATCC923
Pseudomonas aeruginosa ATCC27853
MT nuối cấy: thêm 50% huyết thanh bò, glycerol 10%, -20 đến 60°C để tránh đột biến thuốc

Vật liệu trong phương pháp Kirby-Bauer

Đĩa KS, MT MSA , DD chuẩn độ đục (Mật độ mầm cấy chuẩn 10^8 CFU/ml bằng máy quang phổ kế, so sánh với ống Mc Faland 0,5 - BaSO4.2H2O), Mầm cấy (Chọn 3-4 khúm cấy ống 2-5 ml MT TBS hoặc BHI 37°C 4-6h, chuẩn độ đục và dùng ngay trong 15 phút), VK kiểm chứng

Cách đọc kết quả PP Kirby-Bauer:

Đo đường kính của vòng vô khuẩn (mm) - Không có là kháng thuốc KS đó, và so sánh với bẳng hướng dẫn NCCLS
Nhạy cảm (S): Dùng được để uống, Trung gian (I): Dùng đường tim và Kháng (R).
Tuy nhiên phải chú ý đến đặc điểm: Cơ địa BN, Dược động học, Dược lực học

PP Pha loãng liên tiếp:

Pha loãng trong: Dãy ống nghiệm liên tiếp, Các giếng một phiến nhựa cứng, MT thạch (Đục giếng)
Vật liệu: NB (MT dinh dưỡng lỏng)
PP: MT - CAMHB
Cần điều chỉnh Ca2+ và Mg2+ khi thử P.aeruginosa thử KS aminoglycosides
Tiêu chuẩn mầm cấy: 5 x 10^5 CFU/ml. Từ độ chuẩn pha loãng 1:100, nước muối sinh lý cho vào 1ml KS pha loãng trong MT CAMHB để đạt yêu cầu

Chú ý cách đọc kết quả của PP pha loãng liên tiếp:

Tìm khoảng MIC (nồng độ tối thiểu KS ức chế được VK tăng trưởng quan sát được bằng mắt thường)
Ống 1: Không có MT dinh dưỡng, chỉ có KS nên màu trong.
Ống 10: Chỉ có MT dinh dưỡng, không có KS nên màu đục.

Đọc kết quả bằng PP E-Test:

Xác định MIC bằng cách tìm nơi bất đầu có vòng vô khuẩn quanh bằng giấy tẩm kháng sinh, nồng độ KS càng cao thì vòng vô khuẩn càng rộng

Tính chất chung của VK đường ruột:

Trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi
Đa số di động nhờ chiên mao xung quan thân (Trừ Shigella và Kebsiella)
Lên men Glucose (sinh gas hoặc không)
Khử nitrates thành nitrites
Không sản xuất men Cytochrome-oxidase => Oxidase (-)
VK mọc được trên các MT nuôi cấy thông thường

Các nhóm E.Coli gây tiêu chảy:

EPEC: Enteropathogenic...: Chủ yếu ở trể em
ETEC: Enterotoxigenic...: Độc tố LT, ST
EIEC: Enterovasive...: Xâm lấn tế bào
EHEC: Enterohemorrhagic....: Độc tố verotoxin
EAEC: Enteroaggregative ....: Bám dính niêm mạc ruột

Shigella gây bệnh:

A: S.dysenteriae: độc tố shiga
B: S.fexneri: độc tố giống shiga
C: S.boydii: không tiết độc tốt
D: S.sonnei: Độc tố giống shiga

Salmonella gây bệnh:

220 type HT dựa trên công thực KN O,H,K
Các loại 1983:
S. typhi: Sốt thương hàn
S. choleraesuis: nhiễm trùng máu
S. enteritidis: viêm ruột

Yersinia gây bệnh:

Y. pestis: dịch hạch
Y. enterocolitica: nhiễm trùng tiêu hóa (giống Shigella)
Y. pseudotuberculosis: nhiễm trùng tiêu hóa

Cách lấy và chuyển chở bênh phẩm trong VK đường ruột

Nguyên tắc chung: vô trùng, tránh nhiễm tối đa đối với bệnh phẩm lấy từ vùng da và niêm mạc.
Dịch, mủ: ống vô trùng, chuyển ngay hoặc cho vào MT chuyên chở Cary-Blair
Nước tiểu: lấy giữa dòng, chuyển đi trong vòng 2h
Phân: thời kỳ đầu bệnh trước khi dùng KS

Xác định type hueets thanh các VK gây bệnh đường ruột

E.coli:
EPEC: kháng HT mẫu
ETEC: Tìm độc tố LT: nuôi cấy TB, ELISA, Tìm độc tố ST: chuột sơ sinh
EIEC: giác mạc chuột lang, tế bào hep-2
EHEC: Tìm độc tố verotoxin = TB vero
Shigella: kháng huyết thanh mẫu
Salmonella: kháng huyết thanh mẫu
Yersinia enterocolitica: Kháng huyết thanh mẫu

MT chuyên chở

1. Lưu giữ bệnh phẩm
2. VK đường ruột dùng MT Cary - Blair
3. Ít dinh dưỡng (chỉ có muối đệm)
4. VK không tăng sinh

MT phong phú:

1.Giàu chất dinh dưỡng
2. VK tăng sinh được
3. Thích hợp cho loại VK muốn tăng sinh
4. MT thường dùng: GN (Gram negative), Selenite F broth, BHI

MT phân lập

1. Dùng chọn khuẩn lạc
2. MT không chọn lọc: NA, BA...
3. MT chọn lọc:
Ít: MC, EMB
Vừa: SS
Cao: Bismuth salfite agar, Brilliant green agar
4. MT phân biệt: MC, EMB, SS, BA

MT khảo sát tính chất sinh hóa

KIA, SIM, Citrate, Ure, MR-VP

Đặc điểm của MT chọn lọc ít MC:

Dựa trên nguyên tắc cơ bản: đường kính và màu sắc phân biệt khúm

Khảo sát:

1. Lactose (+) => Hồng, (-) => Vàng

2. Ức chế VK Gram dương

Chất chỉ thị màu: Đỏ trung tính

Đặc điểm MT chọn lọc ít EMB:

Dựa trên nguyên tắc cơ bản: đường kính và màu sắc phân biệt khúm

Khảo sát:

1. Lactose (+) => Đen, (-) => Trắng

2. Ánh kim (+) => Có E.coli

3. Ức chế VK Gram dương

Chất chỉ thị màu: Eosin methylene blue

Đặc điểm MT chọn lọc vừa SS(Shigella, Salmonella) :

Dựa trên nguyên tắc cơ bản: đường kính và màu sắc phân biệt khúm

1. Lactose (+) => Hồng, (-) => Vàng

2. H2S (+) => Đen

Chất chỉ thị màu: Đỏ trung tính

MT TSI khảo sát tính chất gì của VK

Glu

Lac

H2S

Gas

Và khác với MT KIA: Có thêm đường Sucrose

MT KIA

Tỷ lệ Glu/Lac = 1/10

Chất chỉ thị màu: Đỏ phenol

Khảo sát:

1. Glu/Lac: - Thạch đứng (Glu), Thạch nghiêng (lacto): (+) => Vàng, (-) => Đỏ

2. Gas: (+) => Đầy, nứt, có bọt khí

3. H2S (+) => Đốm đen

MT Citrate

Khảo sát: quyết định VK sử dụng Citrate như nguồn carbone duy nhất

(+) => Xanh dương, lá thông (pH = 7,6)

(-) => Xanh lá (pH=6,9)

MT SIM

Khảo sát:

1. H2S (+) => Đen

2. Indol Kovac's (Tạo Indol): (+): màu đỏ, (-): màu vàng

3. Tính di động: (+) Đục thạch, (-): Trong suốt

MT Urea

Chất chỉ thị màu: Đỏ phenol

(+) => Đỏ tím sen (pH > 8,1)

(-) => Vàng, tím nhạt (pH < 6,8)

MT MR-VP

MR: Lên men mạnh, trực tiếp.

Thuốc thử: methyl red

(+) => Đỏ (pH < 4,2)

(-) => Vàng (pH > 6,3)

VP: lên men gián tiếp

Thuốc thử: KOH 40%, α-nepthol

(+) => Đỏ

(-) => Đen, nâu đỏ

Thử nghiệm Cytochrome Oxidase

Thuốc thử: p-phenylenediamine 1%
(+) => Màu tím đen - Không phải VK đường ruột
(-) => Không đổi màu - Là VK đường ruột

Thử nghiệm khử nitrate thành nitrite

MT khử nitrate: 0,1% pstassium nitrate
(+) => Đỏ
(-) => Không đổi màu

Đặc điểm của Staphylococci (tụ cầu)

Xếp thành chùm, hình chùm nho

Cấy trong MT dinh dưỡng (NA) hoặc MT lỏng (NB)

Tính chất: MT chọn lọc MSA 7,5% NaCl

1. Catalase (+)

2. Tiêu huyết hoặc không tiêu huyết

Phân biệt S.aureus với Staphylococci khác:

1. Tiêu huyết (+)

2. Coagluase (+)

3. MSA 7,5% NaCl: mọc

4. Lên men Mannitol

Đặc điểm của Streptococci (Liên cầu khuẩn):

Xếp thành chuỗi, đôi hoặc đám.
Cấy trong MT: BA (thạch máu), CA (thạch nâu), BHI (tím óc hầm) ở 37℃ trong điều kiện khí trường có 5-10%. (Phương pháp Ủ bình nến).
Riêng nhóm D Enterococci mọc được ở 15-45℃ và 6,5% NaCl

Streptococcus (phế cầu)

Hình mũi giáo, xếp thành đôi, chuỗi hoặc tụ đám
MT: BA - Giàu dinh dưỡng, 5-10%,
Tiêu huyết α và Catalase (-), Dễ bị ly giải bởi muối mật và nhạy cảm với Optochin.

Phân biệt giữa Streptococcus pneumoniae với Streptococcus khác

Thử nghiệm Catalase

2H2O2 ==> 2H2O + O2 (men Catalase)
Sủi bọt => (+) - Staphylococci
Không sủi bọt => (-) - Liên cầu hoặc phế cầu

Thử nghiệm Coagulase

Nguyên tắc: Men coagulase có 2 dạng: Dạng liên kết và dạng tự do. Khi gặp huyết tương, có hiện tượng lợn cợn hoặc đông huyết tương.
Tìm Couglase liên kết: 10s => Hạt lợn cợn => Couglase (+)
Tìm Couglase tự do: Sau 1-4h => Đông đặc HT => Couglase (+)
Dùng để phân biệt Tụ cầu vàng (S.aureus) với Staphylococci khác.

Thử nghiệm lên men đường Manitol

Nguyên tắc: S.aureus có khả năng lên men đường mannitol trên MT MSA, acid sinh ra làm đổi màu chất chỉ thị: Đỏ phenol => Vàng.
Chuyển sang màu vàng => Lên men Manitol (+)

Thử nghiệm Hemolysin

Nguyên tắc: 1 số loại Staphylococci như S.aureus có khả năng sinh hemolysin làm ly giải HC.
Đọc kết quả: Xung quanh khúm xuất hiện vòng sáng tiêu huyết do HC bị ly giải => Hemolysin (+)

Thử nghiệm phân loại tiêu huyết của Streptococci

Gây tiêu huyết
α (Tiêu huyết không hoàn toàn): Vòng tiêu huyết mờ, hơi ánh lên màu xanh
β (Tiêu huyết hoàn toàn): Vòng tiêu huyết sáng, trong bao quanh khúm VK
Không tiêu huyết (γ): Không tạo được vòng tiêu huyết

Thử nghiệm nhạy cảm với Bacitracin (Taxo A):

Nguyên tắc: Streptococcus tiêu huyết β nhóm A (Streptococcus pynogens) nhạy cảm với Bacitracin.
Dùng để phân biệt Streptococcus tiêu huyết β nhóm A với nhóm khác.
Đọc kết quả: Chỉ cần xuất hiện vòng vô khuẩn => VK Streptococcus tiêu huyết β nhóm A.

Thử nghiệm CAMP

Nguyên tắc: Streptococci nhóm B (Streptococci agalactial) tiết ra yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với β-hemolysin của S.aureus.
Đọc kết quả: Tiếp cận vạch Staphylococci có vùng tiêu huyết hình mũi tên hướng về => CAMP (+)

Thử nghiệm Bile-Esculin

Nguyên tắc: Streptococci nhóm D có khả năng thủy phân esculin (MT chứa 4% muối mật) => Glucose và esculetin phản ứng với Fe2+ => Màu đen trên bề mặt môi trường.
Esculin + muối mật => màu đen (xúc tác Fe2+)
Đọc kết quả: Xuất hiện màu đen trên bề mặt MT => Thử nghiệm Bile-esculin (+) => Streptococci nhóm D

Thử nghiệm nhạy cảm Optochin (Taxo P)

Nguyên tắc: Pneumococcus nhạy cảm với Optochin.
Dùng để phân biệt với các Streptococci tiêu huyết α khác (S.viridans)
Đọc kết quả: Xuất hiện vòng vô khuẩn có đường kính ≥ 14mm
Optochin (+) => VK thử nghiệm là Pnemococcus.
Lưu ý: Nếu đường kính < 14mm thì cần tiến hành thí nghiệm tan trong muối mật để xác định Pneumococcus.

Thử nghiệm tan trong muối mật

Nguyên tắc: Muối mật làm tăng khả năng ly giải của vi khuẩn Pneumococcus.
Đọc kết quả: Ống nghiệm trở nên đục => Thử nghiệm (+) => KL: Pneumococcus

Cầu khuẩn Gram Âm - Neisseria (Song cầu)

Bắt màu Gram âm, đứng thành đôi một, 2 mặt lõm quay vào nhau giống hạt cà phê.

Mọc trên MT giàu chất dinh dưỡng (BA, CA, BHI, MTM) ở 37℃ trong điều kiện có 5-10% CO2.

VK gây bệnh thường nằm trong TB bạch cầu đa nhân, không mọc trên MT thông thường.

Khả năng: Nội bào.

Glucose (+)

Lên men Maltose.

Định danh dựa vào Thử nghiệm Oxidase (+) và thử Catalase (+)

Phân biệt Neisseria

Phân biệt dựa vào thử nghiệm lên men đường nhanh

- Màu vàng => Thử nghiệm (+)

- Màu đỏ hoặc cam => Thử nghiệm (-)

Thử nghiệm huyết thanh học chẩn đoán bệnh giang mai (Đặc hiệu)

TPI (Treponema pallidum immobilisation): Bất động xoắn khuẩn
FTA (Flourescence Treponema antibody): Kháng thể xoắn khuẩn huỳnh quang
TPIA ( Treponema pallidum immunoadherence): Kết dính miễn dịch
TPHA (Treponema pallidum hemagglutination assay): Ngưng kết hồng cầu
- Nguyên tắc: Dùng HC gà phủ KN T.pallidum dòng Nichol phát hiện KT đặc hiệu của xoắn khuẩn giang mai trong máu BN
- Thử nghiệm định tính
- Thử nghiệm định lượng
o Tìm ra được Hiệu giá kháng thể
o Từ đó: Tăng thì mắc bệnh, Giảm thì không mắc bệnh.
- Đọc kết quả
o 1/2560: Lượng giá kháng thể.
o HC kết thành mạng bao phủ toàn bộ đáy giếng => (+)
o HC đọng lại thành một nút màu đỏ ở giữa đáy giếng => (-)

Thử nghiệm huyết thanh học chẩn đoán bệnh giang mai (Không đặc hiệu)

Phản ứng lên bông VDRL (Veneral Disease Research Laboratories)
Phẩn ứng kết hợp bổ thể BW (Bordet-Wassemann)
Phản ứng ngưng tụ RPR (Repid Plasma Reagin)
- Dùng KN Cardiolipin gắn trên hạt cacbon tìm KT reagin trong máu BN
- Kết quả:
o Có sự kết cụm các hạt cacbon màu đen => (+)

Lưu ý của XN Huyết thanh học trong chẩn đoán bệnh giang mai

1. Tìm Kháng thể trong máu
2. Thời gian xuất hiện kháng thể: IgG, IgM, IgG + IgM
3. Hiệu giá kháng thể
4. Lấy máu 2 lần
5. Lấy máu 1 lần => Trị số có giá trị chẩn đoán

Đặc điểm của bệnh giang mai

1. Xoắn khuẩn Treponema pallidum
- Do Schaudin và Hofmann phân lập 1905
- Hình sóng (hình sin)
- Chuyển động xoay tròn
- Không nuôi cấy được
2. Lây qua đường tình dục và đường máu

3 giai đoạn của bệnh giang mai là:

Sơ đồ phân lập Staphylococci

Sơ đồ phân lập Streptococci