43 DNA diagnostika - priama a nepriama, meróda RFLP, elektroforetogram, sila väzby pri chorobe

DNA diagnostika

= molekulárne genetické vyšetrenie

2 druhy: priama a nepriama

Cieľ DNA diagnostiky

potvrdenie diagnózy choroby podmienenej génovou mutáciou

zistenie genetickej predispozície k ochoreniu v rodinách s určením rizika postihnutia potomkov

Priama DNA diagnostika

priama detekcia známych mutácii
odhalí ne/prítomnosť špecifickej mutácie v DNA
pri vyhľadávaní neznámých mutácii porovnávame odchýlky so základnou sekvenciou

Metódy priamej DNA diagnostiky

PCR
sekvenovanie DNA
Pomocou oligonukleotidových farebných sónd (určenie mutovanej alely v genóme)

Nepriama DNA diagnostika

nepriama detekcia mutácie
je potrebné vyšetrenie viacerých členov rodiny (aspoň 5, zdravých aj postihnutých)

založená na analýze väzieb (identifikujeme fragment DNA, v ktorom je poškodený gén)

Metódy nepriamej DNA diagnostiky

pomocou polymorfizmov DNA (markery) a tandemových repetícii
Southernova hybridizácia

Southernová hybridizácia

1. štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami,

2. elektroforetická separáciu zmesi fragmentov DNA,

3. prenos fragmentov DNA na nylonovú alebo nitrocelulózovú membránu ("blotting"),

4. hybridizácia rádioaktívne značených prób.

Využitie nepriamej DNA diagnostiky u chorôb

pri detekcii chorôb s veľmi veľkými génmi (napr. gén pre dystrofín)

pri existencii homologických pseudogénov

pri rozptýlení mutácie v celej dĺžke génu

RFLP

= restrikčná analýza

využitie restriktáz na štiepenie DNA
naamplifikuje sa gén a pomocou restriktáz sa vyštiepia presne definované sekvencie génov

restriktázy = bakteriálne endonukleázy

používa sa pri Southernovej hybridizácii

Elektroforéza

separačná metóda, ktorá delí molekuly podľa hmotnosti/el. náboja/veľkosti

využíva rozličnú pohyblivosť v elektrickom poli

Southern-blotting

prenos molekúl DNA separovaných gélovou elektroforézou na nitrocelulózovú alebo nylonovú membránu

Hybridizácia sondou

pridanie radioaktívnej DNA sondy s pozorovanou sekvenciou DNA na elektoforegrame → hybridizácia s DNA, ktorá je komplementárna so sondou → vymytie nehybridizovaných sónd a ožiarenie RTG → vyvolanie filmu a interpretácia výsledkov

Interpretácia elektroforetogramu

Informatívne vyšetrenie - môžeme určit fragment, ktorý je vo väzbe s mutovanou alelou

Neinformatívne vyšetrenie - nemôžeme určiť fragment, ktorý je vo väzbe s mutovanou alelou