4) uchovávání a exprese genetické informace

Co je genetická informace?

Soubor instrukcí pro existenci a vývoj živého organismu uložený ve struktuře DNA.

• předává se dceřiným buňkám při buněčném dělení / potomkům při rozmnožování

• prostřednictvím RNA a proteinů, které kóduje, určuje vlastnosti a funkce buněk / organismů

Jaké jsou funkce genetického materiálu?

Uchování, kopírování a přenos genetické informace, řízení růstu a vývoje organizmu (genová exprese, fenotypová funkce), umožnění adaptace organizmů na změny okolí (mutace a přirozený výběr, evoluční funkce)

charakteristika DNA

- molekula složená ze dvou k sobě přiléhajících vláken

- každé vlákno tvořeno řetězcem deoxyribonukleotidů

- jednotlivé nukleotidy spojeny kovalentními vazbami

- příčné spojení vláken zajišťují vodíkové vazby mezi bázemi deoxyribonukleotidů

- pravidlo komplementarity: adenin - tymin a guanin - cytozin

charakteristika RNA

- jednovláknová molekula složená z řetězce ribonukleotidů

- složkami ribonukleotidů jsou báze adenin, uracil, guanin, cytozin

Jaké jsou složky nukleotidů?

- 3 složky: cukr, fosfát, dusíkatá báze spojené kovalentními vazbami

- základem je cukr: ribóza (RNA) nebo deoxyribóza (DNA)

- fosfátová skupina nese negativní náboj

Jaké jsou rozdíly mezi DNA a RNA?

DNA je dvouvláknová, RNA je jednovláknová. DNA obsahuje deoxyribózu, RNA ribózu, RNA obsahuje uracil namísto thyminu.

polymerní struktura NK

- každý polynukleotidový řetězec je polymerem nukleotidů navzájem vázaných kovalentními fosfodiesterovými vazbami, které spojují dvě molekuly obsahující OH skupiny prostřednictvím zbytku kyseliny fosforečné (2 esterové vazby)

- propojení 5´uhlíku na jednom cukerném zbytku s 3´uhlíkem následujícího cukerného zbytku prostřednictvím fosfátu

- důsledkem je polarita nukleových kyselin (odlišné 5´ a 3´ konce)

nukleosid vs. nukleotid

Nukleosid je složen z cukru a dusíkaté báze, zatímco nukleotid obsahuje navíc fosfátovou skupinu.

Ribonukleotid vs. deoxyribonukleotid

Ribonukleotid obsahuje ribózu, zatímco deoxyribonukleotid obsahuje deoxyribózu.

Objev dvoušroubovice DNA

- Maurice Wilkins a Rosalind Franklinová fyzikální data

- rozptyl paprsků rentgenového záření na krystalech molekul DNA

- Erwin Chargaff chemická data

- koncentrace tyminu je v DNA daného organismu vždy stejná jako koncentrace adeninu

- koncentrace cytozinu je vždy stejná jako koncentrace guaninu

Trojrozměrná struktura DNA

- pravotočivá dvoušroubice (B-forma)

- řetězce jsou k sobě vázány vodíkovými vazbami mezi bázemi, proto jsou báze orientovány dovnitř dvoušroubice, cukr-fosfátová kostra je na její vnější straně

- báze se uvnitř dvoušroubice orientují do energeticky nejvýhodnějšího uspořádání

- vinutí vytváří v šroubovici velký a malý žlábek

- vlákna dvoušroubice jsou antiparalelní a plně komplementární

- patrové (nekovalentní) interakce mezi aromatickými jádry přispívají ke stabilitě

kolik bází tvoří jedna otočka DNA

- jednu otáčku šroubovice (3,4 nm) tvoří 10 párů bází

báze DNA

• větší purinová báze (A/G) se páruje s menší pyrimidinovou (T/C)

  • adenin se spojuje s tyminem dvěma vodíkovými vazbami

  • guanin s cytozinem třemi vodíkovými vazbami

konformace DNA

- pravotočivá A-DNA se tvoří v dehydratujícím prostředí

- levotočivá Z-DNA, kde se řetězce nevinou plynule, ale „semtam“ („zig-zag“), popsána in vitro, biologická funkce nejasná

Struktura DNA a genetická informace

- pořadí nukleotidů určuje genetickou informaci

- organizmy se od sebe liší proto, že se jejich DNA liší v pořadí nukleotidů a tím instrukcemi pro tvorbu RNA/proteinů

- lineární sekvence nukleotidů určuje lineární pořadí aminokyselin v proteinech

- lineární sekvence aminokyselin určuje trojrozměrnou strukturu proteinů

- trojrozměrná struktura proteinů zajišťuje funkci proteinů

- před buněčným dělením se genetická informace v DNA kopíruje

Kopírování a přenos genetické informace

- komplementarita vláken dvoušroubovice usnadňuje kopírování genetické informace

- vodíkové vazby mezi vlákny dvoušroubice jsou mnohem slabší než kovalentní vazby mezi sousedními nukleotidy

- s pomocí určitých enzymů lze dosáhnout oddělení vláken a jejich zkopírování do vláken komplementárních = replikace DNA

Co se děje při replikaci DNA?

- po oddělení rodičovských vláken slouží každé z nich jako templát pro syntézu vlákna nového

- nová vlákna vznikají postupným začleňováním nukleotidů na základě pravidel o párování bází a jejich spojováním

- replikace DNA je katalyzována enzymy

- na konci replikace je každé vlákno templátu spárováno s nově syntetizovaným partnerským vláknem

Replikační bubliny a vidlice

- replikace DNA začíná v místech ori replikačních počátcích ("origins")

- po rozvolnění DNA v místě ori bohatém na AT se templátové řetězce oddělují a vzniká replikační bublina

- od tohoto místa replikace probíhá v obou směrech a vzniká struktura tvaru "Y" zvaná replikační vidlice

průběh samostné replikace

- rozvolnění dvoušroubovice: obnažení templátu

- syntéza primeru připojováním ribonukleotidů

- připojení prvního deoxyribonukleotidu

- postupné připojování příslušných deoxyribonukleozidtrifosfátů ve směru 5´- 3´

- odštěpení pyrofosfátu

- vznik fosfodiesterové vazby katalyzováno DNA-polymerázou

RNA primery

- krátké úseky RNA nutné pro iniciaci replikace DNA

- DNA-polymerázy nesyntetizují DNA de novo

- prodlužují již existující řetězec velmi přesné

- RNA-polymerázy méně přesné

- mohou začít tvorbu nového řetězce bez primeru

- slouží k syntéze primerů při replikaci DNA (DNA-primáza)

syntéza lagging strandu

opožďující se řetězec je syntetizován přerušovaně ve směru 5´-3´ s pomocí Okazakiho fragmentů (1000-2000 nukleotidů u prokaryot, 100-200 nukleotidů u eukaryot), které se následně spojí

syntéza RNA-primerů

- tvorbu RNA-primerů zajišťuje DNA-primáza (DNAdependentní RNA-polymeráza), schopná spojit dva ribonukleozidtrifosfáty na templátu DNA

- DNA-primáza syntetizuje krátký polyribonukleotid ve směru 5´-3´

- vedoucí vlákno (leading strand) postačuje jeden RNA-primer na začátku templátu, replikace DNA pak probíhá bez přerušení

- opožďující se vlákno (lagging strand) pro syntézu každého Okazakiho fragmentu musí být vytvořen primer

Spojení Okazakiho fragmentů

- DNA-polymeráza prodlužuje RNA-primer a tvoří nové vlákno DNA

- syntéza Okazakiho fragmentu skončí, jakmile DNA-polymeráza narazí na primer předchozího fragmentu

- při vytváření celistvé struktury DNA opožďujícího se řetězce se uplatňují opravné mechanismy:

- RNA-primery se odstraní (exonukleázová aktivita) a nahradí je DNA

- kovalentní spojení 3´- konce jednoho fragmentu DNA s 5´- koncem sousedního zajistí DNA-ligáza

Odstranění primerů

- RNA-primery odstraňuje 5´- 3´ exonukleázová a nahrazuje polymerázová aktivita DNA-polymerázy

- 3´-OH konec jednoho Okazakiho fragmentu se spojí s 5´-P koncem sousedního Okazakiho fragmentu DNA-ligázou

Sekvenování DNA

- britský biochemik Frederick Sanger (19182013) – 2 x NC (1958,1980)

- Původně se věnoval sekvenování proteinů – degradačním přístupem

- ten ale u DNA nefunguje

- v r. 1975 přichází s nápadem nahradit štěpení DNA syntézou

- syntézu zastavuje ve specifických místech pomocí inhibitorů – dideoxynukleotidů

- elektroforézou stanovuje pořadí fragmentů podle velikosti

- sekvenci nukleotidů stanovuje podle jejího komplementárního obrazu

- takto v r. 1977 osekvenován první genom – bakteriálního viru ΦX174 (5386 pb)

Transkripce

- převedení informace v podobě sekvence deoxyribonukleotidů v DNA do sekvence ribonukleotidů v RNA (transkriptu)

- informace si uchovává stejný obsah i podobnou chemickou povahu, ale je mobilnější

- jedno vlákno DNA genu se použije jako templát pro syntézu komplementárního vlákna RNA

- kóduje-li vzniklý transkript protein, podrobí se následně translaci, tj. informace skrytá v sekvenci ribonukleotidů se převede do pořadí aminokyselin v proteinech

Transkripce a translace u prokaryot

- u prokaryot primární transkript je ekvivalentní molekule mRNA

- mRNA se hned po svém vzniku podrobuje translaci v ribozomech

Transkripce a translace u eukaryot

- u eukaryot primární transkript je prekurzorem mRNA (pre-mRNA)

- pre-mRNA se na obou koncích modifikuje a zbavuje přepisů intronů

- po úpravách se mRNA exportuje do cytoplazmy, kde se podrobí translaci

společné znaky transkripce a replikace

- začíná rozvolněním malé oblasti dvoušroubovice DNA v definovaném místě: obnažení několika bází obou řetězců

- jeden z řetězců DNA slouží jako templát pro syntézu vlákna komplementárního (RNA), která probíhá ve stejném směru 5´-3´

- výběr začleňovaného nukleotidu vyplývá z pravidel o párování bází

- nový nukleotid je do rostoucího vlákna připojen kovalentní vazbou

- vzniklá RNA je přesnou komplementární verzí templátového řetězce

Odlišnosti transkripce a replikace

- přepisuje se jen jeden a nikoliv oba řetězce – přítomnost promotoru

- vzniklý řetězec RNA nezůstává připojen k DNA, ale odvíjí se od něj

- (obnovení dvoušroubovicové struktury DNA)

- velikost transkriptů je podstatně menší než velikost genomu

- transkripci zajišťuje DNA-dependentní RNA-polymeráza, replikaci katalyzuje DNA-dependentní DNA-polymeráza

- žádné primery

RNA-polymerázy

- pohybují se podél DNA, postupně rozvíjejí dvoušroubovici, obnažují templátový řetězec pro párování s komplementárními bázemi

- katalyzují tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi ribonukleotidy

- vznikající řetězec RNA se prodlužuje ve směru 5´-3´

- substráty polymerace jsou ribonukleosidtrifosfáty ATP, CTP, UTP a GTP

Iniciace transkripce u bakterií

- k jádru RNA-polymerázy se připojuje faktor sigma (s)

- tento komplex klouže po molekule DNA

- pokud při pohybu po DNA narazí na specifickou nukleotidovou sekvenci (promotor), naváže se na ni pevněji

- promotor představuje startovní bod transkripce

- faktor sigma zajistí rozeznání promotoru díky specifickým interakcím s bázemi promotoru

Průběh transkripce u bakterií

- RNA-polymeráza se naváže na promotor a rozvolní dvoušroubovici DNA

- obnaží se několik nukleotidů na každém řetězci DNA

- po připojení a spojení prvních cca 10 ribonukleotidů se oslabí vazba mezi RNA-polymerázou/promotorem a jádrem enzymu/faktorem sigma

- uvolnění faktoru sigma

- nastává elongace transkripce, která pokračuje dokud enzym v DNA nezaznamená terminátor

- zde se pohyb RNA-polymerázy zastaví

- řetězec RNA se uvolní (terminace transkripce)

3 typy RNA-polymeráz eukaryot

- strukturní podobnost, různá specifita:

- RNA-polymeráza I: přepisuje geny kódující rRNA

- RNA-polymeráza II: geny kódující proteiny

- RNA-polymeráza III: geny kódující tRNA

rozdíly RNA polymeráz eukaryot

- Eukaryotické RNA-polymerázy se liší ve 2 hlavních aspektech od bakteriální RNA-polymerázy:

- pro iniciaci transkripce nevyžadují faktor sigma, ale více proteinů, tzv. obecných transkripčních faktorů

- musí být schopny zajistit transkripci DNA uspořádané v chromatinu (rozvolnění histonových komplexů)

Jaké faktory ovlivňují iniciaci transkripce u eukaryot?

Obecné transkripční faktory.

Obecné transkripční faktory

- navádějí eukaryotickou RNA-polymerázu přesně na promotor

- podílejí se na rozvolnění řetězců DNA před začátkem transkripce

- uvolňují RNA-polymerázu z promotoru při přechodu z iniciace do elongace

Modifikace primárních transkriptů (hnRNA, heterogeneous nuclear RNA)

- připojení čepičky na 5´-konec („capping”)

- připojení polyadenylačního signálu na 3´-konec

- odstranění nekódujících sekvencí

- umožňují buňce vyhodnotit, že je transkript intaktní a může být přesunut do cytoplazmy

- podíl na translaci

Jaký význam má modifikace 5'-konce mRNA?

- připojení 7-metylguanosinu (čepičky)

- nastává po syntéze prvních cca 25 nukleotidů

- pomáhá buňce odlišit mRNA od jiných RNA

- představuje vazebné místo pro „cap-binding complex“ (CPC), který napomáhá sestřihu a exportu transkriptu z jádra

- podílí se na řízení translace mRNA

Modifikace 3´-konce transkriptu

- enzymatické připojení cca 250 kopií polyA

- stabilizace mRNA (zvýšení odolnosti vůči buněčným nukleázám)

- podíl na exportu mRNA z jádra

Sestřih („splicing“) RNA

- v roce 1977 učiněn překvapivý objev: geny eukaryot jsou rozděleny do kódujících sekvencí (exprimovaných úseků – exonů) a mnoha často rozsáhlých vnitřních nekódujících sekvencí („intervening sequences“ – intronů)

- exony i introny jsou podrobeny transkripci - vzniká hnRNA

- přepisy intronů jsou následně z hnRNA odstraněny sestřihem - vzniká zralá mRNA

Principy translace

- genetická informace se z mRNA pomocí genetického kódu překládá do sekvence aminokyselin v polypeptidu

- původně lineární sekvence nukleotidů v DNA se prostřednictvím mRNA přenese do lineární sekvence aminokyselin v proteinu

podmínkou úspěšné translace v buňce je přítomnost:

- mRNA

- funkčních ribozomů

- 40 až 60 různých tRNA

- aminokyselin a enzymů pro jejich aktivaci (aminoacyl-tRNA syntetáz)

- proteinů zapojených do iniciace, elongace a terminace translace

- správně interpretovaného genetického kódu

Genetický kód

- systém, podle kterého se řadí specifické AMK do polypeptidového řetězce na základě nukleotidové sekvence mRNA

- tři po sobě následující nukleotidy v mRNA (triplet) tvoří kodon, který definuje 1 AMK nebo terminaci translace

- každá AMK je v mRNA určena jedním nebo několika různými kodony

- 64 možných tripletů: 61 určuje 20 aminokyselin + 3 terminaci translace

- kodony v mRNA jsou rozeznávány antikodony v tRNA, které nesou specifické aminokyseliny na základě komplementarity bází

tRNA

- malé RNA (70-95 nukleotidů)

- struktura trojlístku – ramena s dvouřetězcovými úseky

- fungují jako adaptéry mezi aminokyselinami a kodony v mRNA

- obsahují antikodon - sekvenci tří nukleotidů komplementárních ke kodonu mRNA

- k 3’ -konci tRNA je kovalentně připojena určité aminokyselina

- v tRNA se často objevují atypické nukleotidy

Aktivace aminokyselin

- připojení k tRNA

- vysokoenergetická vazba (velmi reaktivní) mezi karboxylovou skupinou aminokyseliny a 3´-hydroxylovým koncem tRNA

- vazbu AMK (=aktivaci, nabití tRNA) katalyzují enzymy aminoacyl-tRNA syntetázy

- existuje alespoň jedna aminoacyl-tRNA syntetáza pro každou z 20 AMK

- aminoacyl-tRNA jsou vlastními substráty proteosyntézy na ribozomech:

- umožňují přiřazení správné AMK k příslušnému kodonu v mRNA

- umožňují přístupnost antikodonu pro reakci s kodonem

- prezentují AMK v takové prostorové konformaci, která umožňuje tvorbu peptidových vazeb

Specifita tRNA

- musí mít správnou sekvenci antikodonu (aby reagovala na správný kodon)

- musí být rozeznána správnou aminoacyl-tRNA syntetázou (aby nesla správnou AMK)

- musí se vázat na správné místo v ribozomech (aby mohla realizovat svou adaptérovou funkci)

Jaké jsou tři vazebná místa na ribozomech?

- A (aminoacylové): váže aminoacyl-tRNA

- P (peptidylové): váže tRNA, ke které je připojen rostoucí polypeptidový řetězec

- E (exit): váže tRNA zbavenou AMK před opuštěním ribozomu

Co je Shine-Dalgarnova sekvence?

- Přítomná v transkriptech prokaryot určených pro translaci

- nezbytná pro sestavení ribozomu ve správném místě transkriptu

- umístěna 7 nukleotidů proti směru translace od iniciačního kodonu AUG

- je komplementární sekvenci blízko 3´-konce 16S rRNA obsažené v malé podjednotce ribozomu

- párování bází mezi SD sekvencí mRNA a 16S rRNA ribozomu umožňuje zahájení translace.

niciace translace u eukaryot

- složitější než u prokaryot

- zapojeno několik rozpustných iniciačních faktorů

- iniciační komplex se tvoří na 5’-konci mRNA za účasti 5´-čepičky

- iniciační komplex prochází mRNA od 5´-konce a hledá iniciační kodon AUG (kódující metionin)

- translace začíná na prvním AUG od 5´-konce mRNA

Elongace translace

- postupné připojování aminokyselin k rostoucímu peptidu

- probíhá obdobně u prokaryot i eukaryot

- Sled událostí:

- iniciační aminoacyl-tRNA je navázána v místě P ribozomu

- přenos iniciační aminokyseliny z tRNA v místě P na tRNA v místě A vytvořením peptidové vazby (peptidyltransferázová aktivita je součástí podjednotky 50S ribozomu)

- posun ribozomu po mRNA vedoucí k umístění dalšího kodonu do místa A

- zároveň se vzniklý dipeptid navázaný na tRNA přemístí z místa A do místa P

- "prázdná" tRNA se přemístí z místa P do místa E

Co způsobuje terminaci translace?

- nastává v okamžiku, kdy do místa A vstoupí terminační kodon: UAA, UAG nebo UGA

- zároveň se do místa A váže uvolňovací faktor

- ke karboxylovému konci vzniklého polypeptidu se naváže molekula vody, což vede k terminaci translace

Vlastnosti genetického kódu

- složen z tripletů nukleotidů určujících aminokyseliny

- triplety se nepřekrývají

- neobsahuje interpunkční znaménka

- je degenerovaný (1 AMK <= více kodonů)

- obsahuje kodony pro začátek a konec translace

- je univerzální

důsledky tripletovosti

- Inzerce/delece jednoho/dvou páru bází mění čtecí rámec

- Inserce/delece 3 párů bází čtecí rámec nemění

Jak se jmenuje enzym, který katalyzuje vytváření fosfodiesterových vazeb během replikace?

DNA-polymeráza.

Co je transkripční faktor sigma?

Faktor, který se připojuje k RNA-polymeráze a pomáhá při iniciaci transkripce u bakterií.

Jaké jsou klíčové kroky v procesu translace?

Iniciace, elongace a terminace.

Co se děje při spliceingu RNA?

Odstranění intronů a spojení exonů za účelem vytvoření zralé mRNA.

Regulace využití genetické informace

- trvale využívané jsou jen některé geny – tzv. provozní geny

- exprese jiných genů je řízena tak, aby jejich produkty byly k dispozici jen tehdy, když jsou potřebné

- proces zapnutí exprese = indukce

- proces vypnutí exprese genů = represe

- zastavení nepotřebné exprese - významná energetická úspora

Co přináší možnost regulace genové exprese?

- diferenciaci buněk téhož organismu a tím funkční specializaci tkání

- možnost reakce na proměnlivé okolní prostředí (např. přizpůsobení metabolismu)

- možnost reakce na stav vnitřního prostředí buňky/organismu (např. procesy hojení, reparace DNA, eliminace infekce)

Take home message

- genetická informace je uložena v nukleotidových sekvencích DNA (vzácně RNA)

- genetická informace je přesně kopírována před každým buněčným dělením semikonzervativní replikací

- genetická informace může být vyjádřena (exprimována) do struktury RNA a proteinů, tím realizuje svou kódující funkci a ovlivňuje chování a vlastnosti buňky

- proces genové exprese zahrnuje složité procesy transkripce a translace

- genetický kód definuje přesný vztah mezi strukturou DNA a strukturou aminokyselin

- využití genetické informace lze regulovat a tím přizpůsobit aktuálním potřebám.