4) uchovávání a exprese genetické informace

Uchování a exprese

Genetická informace

• soubor instrukcí pro existenci a vývoj živého organismu uložený ve struktuře DNA

• předává se dceřiným buňkám při buněčném dělení / potomkům při rozmnožování

• prostřednictvím RNA a proteinů, které kóduje, určuje vlastnosti a funkce buněk / organismů

Funkce genetického materiálu

• uchování, kopírování a přenos genetické informace na potomstvo v nezměněném stavu (genotypová funkce)

• řízení růstu a vývoje organizmu a jeho vlastností (genová exprese, fenotypová funkce)

• umožnění adaptace organizmů na změny okolí (mutace a přirozený výběr, evoluční funkce)

Chemická povaha genetického materiálu

• léta 20. stol.: genetická informace je uložena v DNA (deoxyribonukleové kyselině) – s výjimkou RNA virů

• struktura DNA, způsob uložení a mechanismus kopírování genetické informace objasněny po definování dvoušroubovice DNA Watsonem a Crickem (1953)

  • JUSTICE FOR ROSALIND??!!!!

Struktura DNA a RNA

DNA

• molekula složená ze dvou k sobě přiléhajících vláken

• každé vlákno tvořeno řetězcem deoxyribonukleotidů

• jednotlivé nukleotidy spojeny kovalentními vazbami

• příčné spojení vláken zajišťují vodíkové vazby mezi bázemi deoxyribonukleotidů

• pravidlo komplementarity: adenin - tymin a guanin - cytozin

RNA

• jednovláknová molekula složená z řetězce ribonukleotidů

• složkami ribonukleotidů jsou báze adenin, uracil, guanin, cytozin

Nukleotidy

• 3 složky: cukr, fosfát, dusíkatá báze spojené kovalentními vazbami

• základem je cukr: ribóza (RNA) nebo deoxyribóza (DNA)

• fosfátová skupina nese negativní náboj

Nukleotidy se spojují do polymerů

• DNA A RNA

Nukleotidy se spojují do polymerů

• každý polynukleotidový řetězec je polymerem nukleotidů navzájem vázaných kovalentními fosfodiesterovými vazbami, které spojují dvě molekuly obsahující OH skupiny prostřednictvím zbytku kyseliny fosforečné (2 esterové vazby)

• propojení 5´uhlíku na jednom cukerném zbytku s 3´uhlíkem následujícího cukerného zbytku prostřednictvím fosfátu

• důsledkem je polarita nukleových kyselin (odlišné 5´ a 3´ konce)

Nukleosid není nukleotid

Ribonukleotid není deoxyribonukleotid

Objev dvoušroubovice DNA

• 1953: James Watson a Francis Crick odvodili strukturu DNA na základě těchto údajů:

  • Maurice Wilkins a Rosalind Franklinová fyzikální data

    • rozptyl paprsků rentgenového záření na krystalech molekul DNA

  • Erwin Chargaff chemická data

    • koncentrace tyminu je v DNA daného organismu vždy stejná jako koncentrace adeninu

    • koncentrace cytozinu je vždy stejná jako koncentrace guaninu

Trojrozměrná struktura DNA

• pravotočivá dvoušroubice (B-forma)

• řetězce jsou k sobě vázány vodíkovými vazbami mezi bázemi, proto jsou báze orientovány dovnitř dvoušroubice, cukr-fosfátová kostra je na její vnější straně

• jednu otáčku šroubovice (3,4 nm) tvoří 10 párů bází

• větší purinová báze (A/G) se páruje s menší pyrimidinovou (T/C)

  • adenin se spojuje s tyminem dvěma vodíkovými vazbami

  • guanin s cytozinem třemi vodíkovými vazbami

• báze se uvnitř dvoušroubice orientují do energeticky nejvýhodnějšího uspořádání

• vinutí vytváří v šroubovici velký a malý žlábek

• vlákna dvoušroubice jsou antiparalelní a plně komplementární

• patrové (nekovalentní) interakce mezi aromatickými jádry přispívají ke stabilitě

Další konformace DNA

• pravotočivá A-DNA se tvoří v dehydratujícím prostředí

• levotočivá Z-DNA, kde se řetězce nevinou plynule, ale „semtam“ („zig-zag“), popsána in vitro, biologická funkce nejasná

Struktura DNA a genetická informace

• pořadí nukleotidů určuje genetickou informaci

• organizmy se od sebe liší proto, že se jejich DNA liší v pořadí nukleotidů a tím instrukcemi pro tvorbu RNA/proteinů

• lineární sekvence nukleotidů určuje lineární pořadí aminokyselin v proteinech

• lineární sekvence aminokyselin určuje trojrozměrnou strukturu proteinů

• trojrozměrná struktura proteinů zajišťuje funkci proteinů

• před buněčným dělením se genetická informace v DNA kopíruje

Kopírování a přenos genetické informace

• komplementarita vláken dvoušroubovice usnadňuje kopírování genetické informace

• vodíkové vazby mezi vlákny dvoušroubice jsou mnohem slabší než kovalentní vazby mezi sousedními nukleotidy

• s pomocí určitých enzymů lze dosáhnout oddělení vláken a jejich zkopírování do vláken komplementárních = replikace DNA

Principy replikace DNA

• po oddělení rodičovských vláken slouží každé z nich jako templát pro syntézu vlákna nového

• nová vlákna vznikají postupným začleňováním nukleotidů na základě pravidel o párování bází a jejich spojováním

• replikace DNA je katalyzována enzymy

• na konci replikace je každé vlákno templátu spárováno s nově syntetizovaným partnerským vláknem

Replikační bubliny a vidlice

• replikace DNA začíná v místech ori replikačních počátcích ("origins")

• po rozvolnění DNA v místě ori bohatém na AT se templátové řetězce oddělují a vzniká replikační bublina

• od tohoto místa replikace probíhá v obou směrech a vzniká struktura tvaru "Y" zvaná replikační vidlice

Replikace DNA

• rozvolnění dvoušroubovice: obnažení templátu

• syntéza primeru připojováním ribonukleotidů

• připojení prvního deoxyribonukleotidu

• postupné připojování příslušných deoxyribonukleozidtrifosfátů ve směru 5´- 3´

• odštěpení pyrofosfátu

• vznik fosfodiesterové vazby katalyzováno DNA-polymerázou

Iniciace replikace: RNA-primery

• krátké úseky RNA nutné pro iniciaci replikace DNA

• DNA-polymerázy nesyntetizují DNA de novo

• prodlužují již existující řetězec velmi přesné

• RNA-polymerázy méně přesné

  • mohou začít tvorbu nového řetězce bez primeru

  • slouží k syntéze primerů při replikaci DNA (DNA-primáza)

Jak může DNA růst ve směru 3´- 5´?

• Templátová vlákna jsou antiparalelní, DNA-polymeráza je jednosměrná.

• Jak se může DNA prodlužovat ve směru 3´- 5´?

  • vedoucí řetězec se syntetizuje průběžně ve směru 5´-3´

  • ve směru 3´- 5´ syntéza neprobíhá

  • opožďující se řetězec je syntetizován přerušovaně ve směru 5´-3´ s pomocí Okazakiho fragmentů (1000-2000 nukleotidů u prokaryot, 100-200 nukleotidů u eukaryot), které se následně spojí

Syntéza RNA-primerů

• tvorbu RNA-primerů zajišťuje DNA-primáza (DNAdependentní RNA-polymeráza), schopná spojit dva ribonukleozidtrifosfáty na templátu DNA

• DNA-primáza syntetizuje krátký polyribonukleotid ve směru 5´-3´

• vedoucí vlákno (leading strand) postačuje jeden RNA-primer na začátku templátu, replikace DNA pak probíhá bez přerušení

• opožďující se vlákno (lagging strand) pro syntézu každého Okazakiho fragmentu musí být vytvořen primer

Spojení Okazakiho fragmentů

• DNA-polymeráza prodlužuje RNA-primer a tvoří nové vlákno DNA

• syntéza Okazakiho fragmentu skončí, jakmile DNA-polymeráza narazí na primer předchozího fragmentu

• při vytváření celistvé struktury DNA opožďujícího se řetězce se uplatňují opravné mechanismy:

  • RNA-primery se odstraní (exonukleázová aktivita) a nahradí je DNA

  • kovalentní spojení 3´- konce jednoho fragmentu DNA s 5´- koncem sousedního zajistí DNA-ligáza

Odstranění primerů

• RNA-primery odstraňuje 5´- 3´ exonukleázová a nahrazuje polymerázová aktivita DNA-polymerázy

• 3´-OH konec jednoho Okazakiho fragmentu se spojí s 5´-P koncem sousedního Okazakiho fragmentu DNA-ligázou

Zářezy v DNA spojí DNA-ligáza

Sekvenování DNA

• britský biochemik Frederick Sanger (19182013) – 2 x NC (1958,1980)

• Původně se věnoval sekvenování proteinů – degradačním přístupem

  • ten ale u DNA nefunguje

• v r. 1975 přichází s nápadem nahradit štěpení DNA syntézou

  • syntézu zastavuje ve specifických místech pomocí inhibitorů – dideoxynukleotidů

  • elektroforézou stanovuje pořadí fragmentů podle velikosti

• sekvenci nukleotidů stanovuje podle jejího komplementárního obrazu

• takto v r. 1977 osekvenován první genom – bakteriálního viru ΦX174 (5386 pb)

Genová exprese:

• cesta od DNA k RNA a proteinu

Transkripce

• převedení informace v podobě sekvence deoxyribonukleotidů v DNA do sekvence ribonukleotidů v RNA (transkriptu)

• informace si uchovává stejný obsah i podobnou chemickou povahu, ale je mobilnější

• jedno vlákno DNA genu se použije jako templát pro syntézu komplementárního vlákna RNA

• kóduje-li vzniklý transkript protein, podrobí se následně translaci, tj. informace skrytá v sekvenci ribonukleotidů se převede do pořadí aminokyselin v proteinech

Transkripce a translace

• u prokaryot primární transkript je ekvivalentní molekule mRNA

  • mRNA se hned po svém vzniku podrobuje translaci v ribozomech

• u eukaryot primární transkript je prekurzorem mRNA (pre-mRNA)

  • pre-mRNA se na obou koncích modifikuje a zbavuje přepisů intronů

  • po úpravách se mRNA exportuje do cytoplazmy, kde se podrobí translaci

Transkripce má několik stejných rysů jako replikace DNA

• začíná rozvolněním malé oblasti dvoušroubovice DNA v definovaném místě: obnažení několika bází obou řetězců

• jeden z řetězců DNA slouží jako templát pro syntézu vlákna komplementárního (RNA), která probíhá ve stejném směru 5´-3´

• výběr začleňovaného nukleotidu vyplývá z pravidel o párování bází

• nový nukleotid je do rostoucího vlákna připojen kovalentní vazbou

• vzniklá RNA je přesnou komplementární verzí templátového řetězce

Odlišnosti transkripce a replikace

• přepisuje se jen jeden a nikoliv oba řetězce – přítomnost promotoru

• vzniklý řetězec RNA nezůstává připojen k DNA, ale odvíjí se od něj

• (obnovení dvoušroubovicové struktury DNA)

• velikost transkriptů je podstatně menší než velikost genomu

• transkripci zajišťuje DNA-dependentní RNA-polymeráza, replikaci katalyzuje DNA-dependentní DNA-polymeráza

• žádné primery

RNA-polymerázy

• pohybují se podél DNA, postupně rozvíjejí dvoušroubovici, obnažují templátový řetězec pro párování s komplementárními bázemi

• katalyzují tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi ribonukleotidy

• vznikající řetězec RNA se prodlužuje ve směru 5´-3´

• substráty polymerace jsou ribonukleosidtrifosfáty ATP, CTP, UTP a GTP

Iniciace transkripce u bakterií

• k jádru RNA-polymerázy se připojuje faktor sigma (s)

• tento komplex klouže po molekule DNA

• pokud při pohybu po DNA narazí na specifickou nukleotidovou sekvenci (promotor), naváže se na ni pevněji

• promotor představuje startovní bod transkripce

• faktor sigma zajistí rozeznání promotoru díky specifickým interakcím s bázemi promotoru

Průběh transkripce u bakterií

• RNA-polymeráza se naváže na promotor a rozvolní dvoušroubovici DNA

• obnaží se několik nukleotidů na každém řetězci DNA

• po připojení a spojení prvních cca 10 ribonukleotidů se oslabí vazba mezi RNA-polymerázou/promotorem a jádrem enzymu/faktorem sigma

• uvolnění faktoru sigma

• nastává elongace transkripce, která pokračuje dokud enzym v DNA nezaznamená terminátor

• zde se pohyb RNA-polymerázy zastaví

• řetězec RNA se uvolní (terminace transkripce)

Transkripce u eukaryot

• 3 typy RNA-polymeráz, strukturní podobnost, různá specifita:

  • RNA-polymeráza I: přepisuje geny kódující rRNA

  • RNA-polymeráza II: geny kódující proteiny

  • RNA-polymeráza III: geny kódující tRNA

• Eukaryotické RNA-polymerázy se liší ve 2 hlavních aspektech od bakteriální RNA-polymerázy:

  • pro iniciaci transkripce nevyžadují faktor sigma, ale více proteinů, tzv. obecných transkripčních faktorů

  • musí být schopny zajistit transkripci DNA uspořádané v chromatinu (rozvolnění histonových komplexů)

Obecné transkripční faktory

• navádějí eukaryotickou RNA-polymerázu přesně na promotor

• podílejí se na rozvolnění řetězců DNA před začátkem transkripce

• uvolňují RNA-polymerázu z promotoru při přechodu z iniciace do elongace

Modifikace primárních transkriptů (hnRNA, heterogeneous nuclear RNA)

• připojení čepičky na 5´-konec („capping”)

• připojení polyadenylačního signálu na 3´-konec

• odstranění nekódujících sekvencí

• umožňují buňce vyhodnotit, že je transkript intaktní a může být přesunut do cytoplazmy

• podíl na translaci

Modifikace 5´-konce transkriptu

• připojení 7-metylguanosinu (čepičky)

• nastává po syntéze prvních cca 25 nukleotidů

• pomáhá buňce odlišit mRNA od jiných RNA

• představuje vazebné místo pro „cap-binding complex“ (CPC), který napomáhá sestřihu a exportu transkriptu z jádra

• podílí se na řízení translace mRNA

Modifikace 3´-konce transkriptu

• enzymatické připojení cca 250 kopií polyA

• stabilizace mRNA (zvýšení odolnosti vůči buněčným nukleázám)

• podíl na exportu mRNA z jádra

Sestřih („splicing“) RNA

• v roce 1977 učiněn překvapivý objev: geny eukaryot jsou rozděleny do kódujících sekvencí (exprimovaných úseků – exonů) a mnoha často rozsáhlých vnitřních nekódujících sekvencí („intervening sequences“ – intronů)

• exony i introny jsou podrobeny transkripci - vzniká hnRNA

• přepisy intronů jsou následně z hnRNA odstraněny sestřihem - vzniká zralá mRNA

Principy translace

• genetická informace se z mRNA pomocí genetického kódu překládá do sekvence aminokyselin v polypeptidu

• původně lineární sekvence nukleotidů v DNA se prostřednictvím mRNA přenese do lineární sekvence aminokyselin v proteinu

• podmínkou úspěšné translace v buňce je přítomnost:

  • mRNA

  • funkčních ribozomů

  • 40 až 60 různých tRNA

  • aminokyselin a enzymů pro jejich aktivaci (aminoacyl-tRNA syntetáz)

  • proteinů zapojených do iniciace, elongace a terminace translace

  • správně interpretovaného genetického kódu

Genetický kód

• systém, podle kterého se řadí specifické AMK do polypeptidového řetězce na základě nukleotidové sekvence mRNA

• tři po sobě následující nukleotidy v mRNA (triplet) tvoří kodon, který definuje 1 AMK nebo terminaci translace

• každá AMK je v mRNA určena jedním nebo několika různými kodony

• 64 možných tripletů: 61 určuje 20 aminokyselin + 3 terminaci translace

• kodony v mRNA jsou rozeznávány antikodony v tRNA, které nesou specifické aminokyseliny na základě komplementarity bází

tRNA

• malé RNA (70-95 nukleotidů)

• struktura trojlístku – ramena s dvouřetězcovými úseky

• fungují jako adaptéry mezi aminokyselinami a kodony v mRNA

• obsahují antikodon - sekvenci tří nukleotidů komplementárních ke kodonu mRNA

• k 3’ -konci tRNA je kovalentně připojena určité aminokyselina

• v tRNA se často objevují atypické nukleotidy

Aktivace aminokyselin:

• připojení k tRNA

• vysokoenergetická vazba (velmi reaktivní) mezi karboxylovou skupinou aminokyseliny a 3´-hydroxylovým koncem tRNA

• vazbu AMK (=aktivaci, nabití tRNA) katalyzují enzymy aminoacyl-tRNA syntetázy

• existuje alespoň jedna aminoacyl-tRNA syntetáza pro každou z 20 AMK

• aminoacyl-tRNA jsou vlastními substráty proteosyntézy na ribozomech:

  • umožňují přiřazení správné AMK k příslušnému kodonu v mRNA

  • umožňují přístupnost antikodonu pro reakci s kodonem

  • prezentují AMK v takové prostorové konformaci, která umožňuje tvorbu peptidových vazeb

Specifita tRNA

• musí mít správnou sekvenci antikodonu (aby reagovala na správný kodon)

• musí být rozeznána správnou aminoacyl-tRNA syntetázou (aby nesla správnou AMK)

• musí se vázat na správné místo v ribozomech (aby mohla realizovat svou adaptérovou funkci)

Vazba tRNA k ribozomům

• na každém ribozomu jsou tři vazebná místa:

  • A (aminoacylové): váže aminoacyl-tRNA

  • P (peptidylové): váže tRNA, ke které je připojen rostoucí polypeptidový řetězec

  • E (exit): váže tRNA zbavenou AMK před opuštěním ribozomu

Shine-Dalgarnova sekvence

• přítomná v transkriptech prokaryot určených pro translaci

• nezbytná pro sestavení ribozomu ve správném místě transkriptu

• umístěna 7 nukleotidů proti směru translace od iniciačního kodonu AUG

• je komplementární sekvenci blízko 3´-konce 16S rRNA obsažené v malé podjednotce ribozomu

• párování bází mezi SD sekvencí mRNA a 16S rRNA ribozomu umožňuje zahájení translace

Iniciace translace u eukaryot

• složitější než u prokaryot

• zapojeno několik rozpustných iniciačních faktorů

• iniciační komplex se tvoří na 5’-konci mRNA za účasti 5´-čepičky

• iniciační komplex prochází mRNA od 5´-konce a hledá iniciační kodon AUG (kódující metionin)

• translace začíná na prvním AUG od 5´-konce mRNA

Elongace translace

• postupné připojování aminokyselin k rostoucímu peptidu

• probíhá obdobně u prokaryot i eukaryot

• Sled událostí:

  • iniciační aminoacyl-tRNA je navázána v místě P ribozomu

  • přenos iniciační aminokyseliny z tRNA v místě P na tRNA v místě A vytvořením peptidové vazby (peptidyltransferázová aktivita je součástí podjednotky 50S ribozomu)

  • posun ribozomu po mRNA vedoucí k umístění dalšího kodonu do místa A

  • zároveň se vzniklý dipeptid navázaný na tRNA přemístí z místa A do místa P

  • "prázdná" tRNA se přemístí z místa P do místa E

Terminace translace

• nastává v okamžiku, kdy do místa A vstoupí terminační kodon: UAA, UAG nebo UGA

• zároveň se do místa A váže uvolňovací faktor

• ke karboxylovému konci vzniklého polypeptidu se naváže molekula vody, což vede k terminaci translace

Vlastnosti genetického kódu

• složen z tripletů nukleotidů určujících aminokyseliny

• triplety se nepřekrývají

• neobsahuje interpunkční znaménka

• je degenerovaný (1 AMK <= více kodonů)

• obsahuje kodony pro začátek a konec translace

• je univerzální

Genetický kód je tripletový

• Inzerce/delece jednoho/dvou páru bází mění čtecí rámec

• Inserce/delece 3 párů bází čtecí rámec nemění

Regulace využití genetické informace

• trvale využívané jsou jen některé geny – tzv. provozní geny

• exprese jiných genů je řízena tak, aby jejich produkty byly k dispozici jen tehdy, když jsou potřebné

• proces zapnutí exprese = indukce

• proces vypnutí exprese genů = represe

  • zastavení nepotřebné exprese - významná energetická úspora

Co přináší možnost regulace genové exprese?

• diferenciaci buněk téhož organismu a tím funkční specializaci tkání

• možnost reakce na proměnlivé okolní prostředí (např. přizpůsobení metabolismu)

• možnost reakce na stav vnitřního prostředí buňky/organismu (např. procesy hojení, reparace DNA, eliminace infekce)

Take home message

• genetická informace je uložena v nukleotidových sekvencích DNA (vzácně RNA)

• genetická informace je přesně kopírována před každým buněčným dělením semikonzervativní replikací

• genetická informace může být vyjádřena (exprimována) do struktury RNA a proteinů, tím realizuje svou kódující funkci a ovlivňuje chování a vlastnosti buňky

• proces genové exprese zahrnuje složité procesy transkripce a translace

• genetický kód definuje přesný vztah mezi strukturou DNA a strukturou aminokyselin

• využití genetické informace lze regulovat a tím přizpůsobit aktuálním potřebám.