11 tema

Pagrindinės pirminių transkriptų modifikacijos:

• šalinami RNR fragmentai;
• prijungiamos RNR sekos, kurių nėra pirminiuose transkriptuose;
• modifikuojami RNR nukleotidai (kovalentinės modifikacijos);
• vyksta redagavimo (nukleotidų keitimo) įvykiai.

Subrendusios tRNR molekulės turi būti struktūriškai panašios:

taip užtikrinama, kad su jomis galėtų sąveikauti transliacijos elongacijos veiksniai ir kad jos visos “tiktų” ribosomos A srityje;

tRNR turi būti ir skirtingos:

nes jas turi atpažinti skirtingos aminoacil-tRNR sintetazės.

Dirbant su RNR yra reikalinga:

ypatinga švara!

Nespecifinė endonukleazė

pirmenybę teikianti viengrandžių sekų, A / U turinčių, skaidymui

RNazė III

pirmoji identifikuota dvigrandė endoribonukleazė;

RNazė P atrasta

1972 metais Sidney Altmano;

RNazė P yra visų organizmų ląstelėse, kuriose vyksta

tRNR sintezė: bakterijose, archėjose, eukariotų branduolyje, eukariotų mitochondrijose ir chloroplastuose.

RNazė P yra ribonukleoproteinas, kurio RNR komponentas pasižymi

kataliziniu aktyvumu.

RNazė T atsakinga už:

3‘ galinių adenozinmonofosfatų pašalinimą nuo tRNR CCA sekoje

RNazėP skelia lyderinę seką:

pre-tRNR 5’- gale

RNazėP yra

ribonukleoproteinas,

Pre-tRNR brendimas. 5’-galo skėlimas-

RNazė P

Pre-tRNR brendimas. 3’-galo skėlimas ir ardymas-

endonukleazės ir egzonukleazės

Pre-tRNR brendimas. Nukleotidų kovalentinės modifikacijos-

atlieka įvairūs fermentai

Pre-tRNR brendimas. Introno (ų) iškirpimas ir likusių dalių (egzonų) sujungimas-

(įvairūs fermentai

Pre-tRNR brendimas prokariotuose. Bakterijose pre-tRNR transkriptai dažniausiai yra-

policistroniniai ir turi daugiau nei vieną individualią tRNR

Pre-tRNR brendimas prokariotuose.5’-galinę – lyderinę seką – atpažįsta ir skelia ribozimas –

RNazė P (endoribonukleazės aktyvumas)

Pre-tRNR brendimas prokariotuose. Individualias tRNR iš pirminio transkripto skelia kitos endoribonukleazės, o 3’-galą trumpina

egzoribonukleazės

Pre-tRNR brendimas prokariotuose. 3‘-galas – priekabos seka –

gali būti ir skeliama (jeigu nėra CCA) vienu endonukleolitiniu skėlimu – RNazė Z

Pre-tRNR brendimas prokariotuose. 5’CCA-3’ galą (daugeliu atveju tRNR genai tokios sekos nekoduoja) jungia-

tRNR nukleotidiltransferazė

Endonukleolitinis 3’-galo brendimo kelias:

skėlimas vyskta už nt diskriminatoriaus su RNaze Z;

Diskriminatorius –

– paskutinis pretRNR nt prieš jungiant CCA seką.

5’-CCA-3’ seka tRNR molekulių 3’-gale yra esminė

tRNR aminoacilinimui

CCA jungiantis fermentas –

tRNR nukleotidiltransferazė – jungia CCA prie pre-tRNR 3‘- galo;

Pre-tRNR brendimas eukariotuose.

• 5’ lyderinės (angl. leader) sekos pašalinimas (RNazė P);
• 3’ priekabos (angl. trailer) sekos pašalinimas (endonukleazės ir egzonukleazės, RNazė Z);
• 5’-CCA-3’ jungimas 3’-gale (tRNR nukleotidiltransferazės);
• Kovalentinės modifikacijos (įvairūs fermentai);
• Intronų pašalinimas kai kuriose tRNR (fermentų kompleksas).

Intronų iškirpimas ir egzonų sujungimas (splaisingas)

sudėtinė RNR brendimo dalis

Intronai iš pre-iRNR iškerpami dalyvaujant molekulinei mašinai –

splaisosomai.

Splaisingas:

• Intronas;
• Egzonas.
• 5’ splaisingo sritis;
• 3’ splaisingo sritis.

Intronai iš pre-tRNR iškerpami savitu keliu, dalyvaujant

fermentų kompleksui

Dalimis koduojamų tRNR gali koduoti ir intronų dalis, kurie pašalinami:

trans splaisingo būdu

Būdingos visų organizmų pre-tRNR brendimui:

• žinoma ~100 skirtingų modifikacijų;
• vyksta branduolyje, citozolyje, organelėse;

16S ir 23S rRNR iš transkripto skelia RNazė III

iš abiejų stiebo pavidalo struktūros pusių;

Kovalentinių modifikacijų taikinių nustatyme dalyvauja mažos branduolėlio RNR –

snoRNR (angl. small nucleolar RNA).

Aukštesniųjų eukariotų rRNR yra:

~ 110 2’-O-metilintų ribozių;
~ 95 pseudouridinai (Ψ- psi);

snoRNR, mažos branduolėlio RNR:

• Dalyvauja rRNR modifikacijų taikinių nustatyme;
• 70–300 nt ilgio RNR molekulės;
• Sintetinamos nukleoplazmoje;
• Modifikacijos vieta nustatoma komplementarumo principu;
• Nuo 1000 iki 10 000 kopijų branduolyje.

snoRNR nt sekos suskirstytos į dvi grupes:

– C/D dėžutę, kuri dalyvauja nustatant taikiniui 2’ O ribozės metilinimui rRNR molekulę:
• C dėžutės konservatyvi seka – RUGAUGA/U;
• D dėžutės konservatyvi seka – CUGA.
– H/ACA dėžutė, kuri padeda nustatyti uridino nt, kurie verčiami į pseudouridiną:
• H dėžutės seka – ANANNA;
• ACA sritis – nutolusi per 3 ribonukleotidus nuo snoRNR 3’ galo.

snoRNR, mažos branduolėlio RNR:

• Funkcionuoja kartu su savitaisias baltymais kaip snoRNP kompleksai;
• Prie kiekvienos prisijungę bent 4 baltymai, vienas jų ir turi modifikuojantį aktyvumą;
• Pvz.: žmogaus fibrilarinas (pagrindinis branduolėlio baltymas) yra 2’-O-metiltransferazė, o diskerinas – pseudouridino sintazė.

rRNR molekulėje buvo atrastas pirmasis

savaime išsikerpantis (angl. selfsplicing) intronas ir taip išaiškintas dar vienas splaisingo tipas

rRNR pirmtako genas turi

413 bp introną (intervening sequence, IVS);

Nustatyti trys skirtingi splaisingo mechanizmai:

– I grupės intronų iškirpimas;
– II grupės intronų iškirpimas;
– Slpaisosoma.

I ir II grupės intronų splaisingas yra vadinamas

autosplaisingu

T. Cech ištirtas pre-rRNR intronas pasižymi:

savita erdvine struktūra;
Išsikerpa savaime, taigi, yra ribozimas;
Priklauso vadinamajai I-ai savaime išsikerpančių intronų grupei;

I-os grupės savaime išsikerpantys intronai randami:

Vienaląsčių eukariotų branduolio rRNR;
Žemesniųjų eukariotų mitochondrijų / chloroplastų iRNR, tRNR, rRNR;

I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Išsikirpimo mechanizmas:

Dvi trans esterinimo reakcijos, fosfoesterinių ryšių skaičius lieka nepakitęs;
Reakcija grįžtama, bet in vivo kofaktoriaus perteklius stumia ją į produkto susidarymo pusę;

I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Reakcijai vykti būtinai reikia:

• pre-rRNR;
• Mg2+ jonų;
• kofaktoriaus – guanozino (nukleofilas).

Kofaktorius turi turėti

3’-OH grupę ir guanino bazę

I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Kur prijungiamas guanozino kofaktorius?

Guanozino kofaktorius prijungiamas introno guanozino kišenėje ir tiksliai išdėstomas pirmai trans esterinimo reakcijai;

I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Kuom svarbūs Me2+ jonai?

Me2+ jonai (Mg2+) svarbūs erdvinei struktūrai ir dalyvauja katalizėje

Kas nedalyvauja II-os grupės savaiminiam išsikirpime?

Nedalyvauja kofaktorius

Nukleofilas tai-

– introne esančios adenino nukleotido 2’-OH grupė

Po pirmos trans esterinimo reakcijos susidaro tarpinė kilpos pavidalo struktūra –

lasas (angl. lasso) su papildomu 2’-5’ fosfodiesteriniu ryšiu;

Kelintais metais atrasti intronai?

1977 m. tiriant adenoviruso iRNR (F. Sharp ir R. Roberts)

Eukariotų iRNR 5‘-galas. Kepurė tai-

struktūra eukariotų RNR polimerazės II transkriptuose;

Yra žinoma įvairių kepurės struktūrų.
Labiausiai paplitusi: eukariotų iRNR –

m7G;

Trifosfatazė –

pašalina fosfatą, hidrolizuodama trifosfatą 5’-gale iki difosfato;

Guanililtransferazė –

prie 5’-galo jungia GMP 5’-5’ ryšys);

7-metiltransferazė –

metilina galinio nukleotido (GMP) guanino heterociklinę bazę 7 padėtyje.

Kuom svarbi Cap1 modifikacija?

svarbi atskiriant “savą” iRNR nuo virusinės.

iRNR molekulių 3’-gale per brendimą prijungiama eilė

A nukleotidų.

Poli (A) (angl. polyA tail) sekos funkcijos:

• padidina iRNR molekulės stabilumą;
• užtikrina veiksmingą iRNR transliaciją;
• reikia iRNR išnašai iš branduolio į citozolį.
• poliadenilinimas yra tiesiogiai susijęs su RNR Pol II transkripcijos terminacija.

Poliadenilinimui reikia:

• cis sekų (pre-iRNR molekulės 3’ gale);
• trans veiksnių: ▪ šerdiniai veiksniai (skėlimo ir poliadenilinimo kompleksas); ▪ pagalbinių veiksnių (angl. auxiliary factors)

Šerdiniai polidenilinimo veiksniai:

• CPSF ir CstF jungiasi atitinkamai prie PAS ir G / U sričių;
• Skėlimo veiksniai CFI ir CFII.

Poli (A) polimerazė, PAP , būna

kelių izoformų.

Poliadenilinimo signalinė seka, PAS :

• labai konservatyvi;
• svarbi skėlimui ir poliadenilinimui (10 / 30 nt) nuo skėlimo vietos;

Ką užtikrina cis ir trans veiksniai?

splaisingo tikslumą ir veiksmingumą;

Splaisingo cis veiksniai:

• konservatyvios sritys intronuose ir egzonuose:
• 3’ splaisingo sritis;
• 5’ splaisingo sritis;
• šakojimosi taško seka (angl. branch point sequence);
• polipirimidinų ruožas;
• splaisingo stiprikliai ir slopikliai (angl. enhancers and silencers).

Splaisingo trans veiksniai:

• Splaisosoma;
• Splaisingo veiksniai:
▪ SR šeimos baltymai;
▪ heterologiniai branduolio baltymai, hnRNP.

Splaisingo chemija –

dvi trans esterinimo reakcijos: