kwasy nukleinowe biochemia kolokwium

nukleozyd

zasada azotowa i cukier (pentoza) połączone wiązaniem N-glikozydowym

nukleotyd

ester kwasu fosforowego i nukleozydu (5’ monofosforany nukleozydów)

zasady azotowe - podział

pirymidynowe - cytozyna, tymina, uracyl
purynowe - adenina, guanina

pentozy budujace nukleozydy

beta-D-ryboza - -OH przy C2
beta-D-2-deoksyryboza - -H przy C2

nukleozydy w DNA

deoksynukleozydy:

deoksyadenozyna
deoksyguanozyna
deoksycytydyna
deoksytymina

nukleozydy w RNA

nukleozydy:

adenonyza
guanozyna
cytydyna
urydyna

AMP/ADP/ATP

adenozyno - monofosforan/difosforan/trifosforan - zależnie od ilości reszt fosforanowych

budowa łańcucha nukleotydów

nukleotydy połączone przez wiązania 3’-5’ fosfodiestrowe (grupy -OH kolejnych cukrów)

wiązania wodorowe między zasadami azotowymi

guanina - cytozyna → trzy wiązania wodorowe
adenina - tymina → dwa wiązania wodorowe
w dwuniciowych fragmentach RNA adenina/uracyl też dwa wiązania

lokalizacja DNA

jądro komórkowe (chromosomy)
mitochondria (koliste cząsteczki 15kb)
chloroplasty (koliste cząsteczki 120kb)
plazmidy/nukleoidy (bakterie)

RNA kodujący białka

mRNA, stanowi 5% całości RNA, nosi kod genetyczny skopiowany z DNA

RNA niekodujący białek

konstytutywne - tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA

regulatorowe - miRNA, siRNA, lncRNA

izolacja DNA z komórek - etapy

1 - liza komórek

2 - oddzielenie DNA od reszty komórki

3 - zagęszczenie preparatu i usunięcie zanieczyszczeń

izolacja DNA - liza komórek

1) rozbicie ściany (np. ucieranie)
2) uwolnienie DNA do buforu ekstrakcyjnego
3) inaktywacja enzymów nukleolitycznych

izolacja DNA - liza komórek - bufor ekstrakcyjny

np. CTAB

sól
Tris-HCl
EDTA

izolacja DNA - liza komórek - bufor ekstrakcyjny - sól (funkcja)

DNA jest jonowy, więc jest bardziej stabilny i rozpuszczalny w roztworze soli, np. NaCl, niż w wodzie destylowanej

izolacja DNA - liza komórek - bufor ekstrakcyjny - Tris-HCl (funkcja)

utrzymywanie stałego lekko zasadowego pH, co zmniejsza oddziaływania elektrostatyczne DNA/białka zasadowe

izolacja DNA - liza komórek - bufor ekstrakcyjny - EDTA (funkcja)

wiąże jony metali - hamuje tworzenie soli z resztami fosforanowymi, hamuje aktywność deoksyrybonukleaz

izolacja DNA - oddzielenie DNA od reszty komórki

najpierw następuje dysocjacja kompleksów DNA-białko, potem oddzielenie DNA przez ekstrakcję

izolacja DNA - oddzielenie DNA od reszty komórki - dysocjacja kompleksów DNA-białko

SDS - nadaje białkom silnie ujemny ładunek, denaturacja deoksyrybonukleaz
stężone sole - dysocjacja kompleksów + usuwanie kationowych poliamin

izolacja DNA - oddzielenie DNA od reszty komórki - ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym

surowy lizat traktujemy 1:1 rozpuszczalnikiem organicznym (chloroform/fenol); po odwirowaniu otrzymujemy trzy fazy:

a - faza wodna - zawiera wodę, kwasy nukleinowe, inne cząsteczki
b - interfaza - nierozpuszczalne resztki
c - faza organiczna - białka, lipidy, rozpuszczalnik

izolacja DNA - zagęszczanie preparatu

wytrącenie kwasów nukleinowych izopropanolem i solami, przemywanie etanolem i rozpuszczanie w wodzie

izolacja DNA - zagęszczanie preparatu - funkcja soli i rozpuszczalnika organicznego

rozpuszczalnik organiczny - np. izopropanol, etanol - zmniejsza polarność środowiska i DNA wytrąca się jako nitkowaty osad
sole/jony zwiększają efektywność wytrącania ponieważ neutralizują grupy fosforanowe

dlaczego możliwa jest absorbcja UV przez kwasy nukleinowe?

wiązania podwójne i pierścienie heterocykliczne zasad azotowych (max. absorbancji przy 260nm)

A260 = 1 (RNA/dsDNA/ssDNA)

dla RNA 40μg/ml
dla dsDNA 50μg/ml
dla ssDNA 33μg/ml

oznaczanie czystości kwasów nukleinowych

współczynnik A260/A280 (kwasy nukleinowe/zanieczyszczenia białkami i fenolem)
współczynnik A260/A230 (kwasy nukleinowe/zanieczyszczenie węglowodanami/peptydami)

A260/A280 - wolne od zanieczyszczeń dsDNA = 1,8 i RNA = 2

A260/A230 - wolne od zanieczyszczeń powyżej 2

próba Biala - co wykrywamy

próba na pentozy (RNA) - pentozy, ich estry fosforanowe, ryboza w nukleozydach/nukleotydach purynowych

próba Biala - zasada działania, wynik

pentozy ogrzane ze stężonym HCl ulegają odwodnieniu do furfuralu; furfural kondensuje z orcyną w środowisku Fe3+ tworząc zielony kompleks

próba Dischego - co wykrywa, zasada

deoksyryboza w środowisku kwaśnym zmienia się w aldehydową pochodną, która ulega kondensacji z difenyloaminą do niebieskiego kompleksu

metoda orcynowa

działa na tej samej zasadzie co próba Biala; dzięki pomiarowi w spektrofotometrze A670nm możemy określić stężenie RNA w próbce

czym jest efekt hiperchromowy?

polega na zwiększeniu absorbancji w trakcie denaturacji DNA; zmienia się gęstość optyczna, skręcalność optyczna, lepkość, współczynnik S

oznaczenie efektu hiperchromowego (podgrzewanie DNA)

podgrzanie w łaźni = denaturacja

stopniowe ochłodzenie = renaturacja

gwałtowne ochłodzenie = utrwalenie denaturacji

temperatura topnienia DNA (definicja)

taka temperatura, w której połowa DNA występuje w formie natywnej, a połowa w zdenaturowanej; im więcej par G≈C, tym większa temperatura topnienia

rodzaje degradacji RNA/DNA

chemiczna/enzymatyczna

chemiczna degradacja DNA/RNA

ogrzewanie z kwasami, następuje hydroliza do zasad purynowych i nukleozydów pirymidowych, część zasad azotowych ulega destrukcji

enzymatyczna degradacja DNA/RNA - enzymy

nukleazy - deoksyrybonukleazy i rybonukleazy

endonukleazy/egzonukleazy

charakterystyka endonukleaz

hydrolizują wiązania estrowe wewnątrz cząsteczki

endonukleazy - rodzaje

niespecyficzne i specyficzne

endonukleazy niespecyficzne (przykłady)

niezależne od sekwencji - DNAza I + RNAza A

endonukleazy specyficzne

= restryktazy, enzymy restrykcyjne np. EcoRI, rozcinają konkretną sekwencję

egzonukleazy

odcinają nukleotyd od zewnątrz; działają od końca 3’ albo od końca 5’

trawienie DNA za pomocą DNAzy I - wynik elektroforezy, wpływ stężenia

jest to endonukleaza niespecyficzna, więc w elektroforezie otrzymujemy smear - mieszanina odcinków o różnej długości

im mniejsze stężenie enzymu, tym dłuższe odcinki pozostaną w roztworze

restryktazy - charakterystyka

- przecinają wiązania fosfodiestrowe w ściśle określonych, charakterystycznych dla enzymu miejscach

- max. aktywności w 37 stopniach

- izolowane z bakterii i sinic

- działają w obrębie sekwencji palindromowych

typy izolowanych restryktaz

EcoRI/Hind IIi

enzymy klasy II

rozpoznają specyficzne sekwencje w DNA

rozcinają cząsteczkę w dwóch miejscach

aktywność zależy od jonów magnezu

zbudowane z prostych polipeptydów

restryktazy - miejsca przecięcia

mogą być symetryczne (tępe końce) albo niesymetryczne (lepkie końce) - lepkie końce charakteryzują się krótkimi 1-niciowymi fragmentami, których komplementarność umożliwia ligację

restryktazy - użycie do klonowania DNA

trawimy wektor i wstawkę tym samym enzymem, generującym lepkie końce; po wstawieniu do wektora DNA namnaża się

restryktazy - użycie w diagnostyce

wprowadzamy restryktazę do DNA, przeprowadzany elektroforezę i obserwujemy wyniki; jeśli nasza restryktaza miała przecinać zdrową sekwencję to zobaczymy rozcięte DNA, jeśli gen jest zmutowany, restryktaza nie zadziała

rodzaje rozdziału kwasów nukleinowych

sedymentacyjny, chromatograficzny, elektroforetyczny

eletroforeza DNA/RNA - rodzaje

- w agarozie (pulsacyjna - kilkadziesiąt kpz lub klasyczna - do 50 kpz)

- PAGE (do 1kpz)

- w warunkach denaturujących - RNA

elektroforeza kwasów nukleinowych w żelu agarozowym - żel

agaroza - polisacharyd, pochodne galaktozy, stężenie 0,5-2%

elektroforeza kwasów nukleinowych w żelu agarozowym - szybkość migracji

zależna od: wielkości cząsteczki, konformacji DNA, napięcia, stężenia agarozy

elektroforeza kwasów nukleinowych w żelu agarozowym - wizualizacja

bromek etydyny/coomasie/srebro

elektroforeza RNA w warunkach denaturujących - dlaczego?

RNA tworzy II i III rzędowe struktury, zaburzające migrację w żelu

elektroforeza RNA w warunkach denaturujących - denaturacja

formaldehyd, formamid, glikosal

elektroforeza RNA w warunkach denaturujących - wyniki

po rozdziale widoczne prążki rRNA 28S i 18S (2:1) - brak degradacji RNA i dobrej jakości preparat