Kursprov bioteknik

Bioteknik

De tekniska uttnytjandet av celler.

Bröd, fil, ost, insulin

Myntades av Karl Ereky 1919

Bioteknik 4 grupper

Genomik

Metagenomik

Transkriptomik

Proteomik

Användningsområde i samhället

Matproduktion

Hälsovårdande funktioner

EN funktion för hållbarutveckling

Fermentering

Jäsning - bryta ner utan syre

Morfologiska grupper

Bygger på bakteriens utseende

Kocker, stavar, spiriller eller spiroketer

Kocker

Runda

Stavar

Baciller ( avlånga & cylindriska)

Spirill

Spiralformade & rör sig med hjälp av flagell

Spiroketer

Tunnare & mer vridna än spiriller. Rör sig med roterande cellrörelser

Grupp baserat på cellens uppbyggnad

Grampositiva G⁺

Gramnegativa G^{- 2 cellmembran}

Dikocker

2 kockar bredvid varandra

Streptokocker

Flera kocker på en lång rad

Stafylokocker

Flera kocker i en klump

Generellt består bakterier av

Nukleinsyra

Cellmembran

Ribosomer

DNA & RNA

Cytoplasma

Övriga strukturer i bakterier

Plasmider

Flageller

Kapsel

Endosporer

Cellvägg

Pili

Inklusionskroppar

Nukleinsyra

Ringformad DNA dubbelhelix som är fäst i cellmembranet.

Kromosomen replikeras enbart inför celldelning

Ribosomen

Byggs upp av rRNA & proteiner, 2 subenheter

Translaterar mRNA till Aminosyrasekvens

Svedbergsenheten

Mått på den hastighet en mackromolekyl sedimenterar. Enhet: S

Plasmider

En ringformad DNA-molekyl (mindre än kromosomen)

Innehåller enstaka gener replikeras autonomt inte enbart vid celldelning.

Kan infoga utvalda gener

Kodar för till exempel antibiotikaresistens och kan mha F-pili överföras mellan bakterier.

Cellmembranet

Dubbelt lager fosfolipider.

Hydrofila ämnen måste passera genom kanalproteiner vilket ger cellen kontroll över ämnestransport.

Cellmembran - Steroler (kolesterolr)

Finns inte i bakterier, däremot har liknande molekyler hittats.

Cellmembran - Hopanoider

Finns & det stabiliserar cellmembranet.

Modell organism

För att studera

Bananflugor

Används för att studera ärftligheten iom deras snabba utveckling

Systematik - Eukaryot → djur

Latin - Drosophila melanogaster

Zebrafisk

Används för att studera fosterutveckling & hur den påverkas av miljögifter & läkemedel.

Systematik - Eukaryot → djur

Latin - Danio rerio

Cellväggen

Kan saknas hos vissa bakterier (ex mycoplasma (lunginflamation))

Funktion: Skyddar cellen från att sprängas av det höga vätsketrycket inuti cellen.

Skydd mot toxotiska ämnen

Möjligör olika former.

Cellväggen uppbyggnad

Byggs upp av peptidoglykan, en polysackarid som är uppbyggd av N-acetylglukosamin(NAG) & N-acetylmuraminsyra(NAM).

NAG & NAM binder till varandra med kovalentabindningar. På varje NAM sitter en peptid av fyra AA som kan variera. Peptiderna mellan olika NAM kan binda till varandra & då skapas stabiliserande tvärbryggor.

Grampositiva bakterier

Upp till 40 lager peptidoglykan.

Ibland teikonsyra insprängt i cellväggen → negativit laddad yta → lättare bindning till ytor → lättare infektion av människokroppen.

Ibland lipoteikonsyra som binder till lipid i cellmembranet (fäster cellvägg i cellmembran).

Gramnegativa bakterier

Tunt lager (1) peptidoglykan.

Yttligare ett cellmembran (yttre membranet)

Yttremembranet byggs upp av: Dubbelt lager fosfolipider, Lipoproteiner, Poriner (släpper igenom ämnen), LPS-komplexet(Lipopolysackarid)

LPS-komplexet

En lipid del som sticker ned i det yttremembranets fosfolipidlager.

Till lipid A binder en polysackaridkedja där den ena delen är konstant (lika hos alla) medan den andra varierar.

Konstant polysackarid + O-antigen(varierar) = en polysackaridkedja

O-antigen

Kan skilja sig år mellan olika stammar av samma bakterieart för att särskilja olika stammar analyserar man O-antigen med specifika antikroppar.

Lipid A

Är ett endotoxin. Vid frigörning (ex bakretiedöd) kan det leda till kraftiga reaktioner hos däggdjurs immunförsvar. Symtom kan vara kräkningar, diarre samt feber. Ibland så kraftiga att det leder till skador & död.

Ex släkterna Shigella, Salmonella & Eschericha har endotoxiner som påverkar däggdjur.

Endotoxiner

Vid figörning kan det leda till bakretiedöd. Hos däggdjur ger kräkningar, feber & diarre. Kan leda till allvarliga skador & död.

Är värmestabila & bibehåller sin struktur vid uppvärmning.

Mat som uppättas kan därför ändå förgifta även fast bakterien är död.

Periplasmatiska rummet

En gele liknande vätska som innehåller en hög halt proteiner. Vissa fungerar som hydrolytiska enzymer och bryter ner stora molekyler till mindre delar. Andra p binder till ämnen som ska transporteras in i cellen.

Bakteriens uppbyggnad (yttre cellstrukturer)

Kapsel

Pili (F-pili & P-pili)

Flageller

Endosporer

Kapsel

Uppbyggd av polysackarider (ibland polypeptider & båda) vilker ger en kladdig yta.

Skyddar mot uttorkning & tvd från immunsystemet hos värdorganismen.

Gör att bakterier kan kladda sig fast i varandra & bilda biofilmer på ytor. (ex borstars biofilmen bort vid tandborstning).

Pili

Korta utskott från cellytan

Byggs av proteiner, 2 funktioner

F-pili: Används vid överförning av genetiskt material mellan bakterier.

P-pili: Fäster bakterien till en yta. De flesta pili är nischerade till en specifik kolhydrat på den cell där det ska fästa in.

F-pili

Används vid överförning av genetiskt material mellan bakterier.

P-pili

Fäster bakterien till en yta. De flesta pili är nischerade till en specifik kolhydrat på den cell där det ska fästa in.

Flageller

Varierar i antal beroende på släkterna.

Byggs av proteiner & består av:

Basallkropp (ligger mot cellmembranet)

Krok & Filament

Används för att bakterierna ska kunna röra sif, hastigheten kan ligga upp emot 20-200mikrometer per sekund.

Endosporer

En del grampositiva bakterier kan bilda endosporer vid stress från omgivningen.

Det är ett dvalliknande tillstånd där varken reproduktion eller metabolism äger rum. Endosporer innehåller endast 15% vatten jämfört med levande stadie då vatten 70%.

är mer motståndskraftiga mot värme & UV-ljus.

Kan ligga vilande i 100-tals år.

Vanliga hos Clostridium & Bacillus.

Färgning

För att se bakterier (som ofta ger dålig kontrast mot omgivningen kan man använda färgningsmetoder. 3st

Negativ färgning

Bakgrunden färgas, ej cellerna. Ingen fixering sker vilket förhindrar att färgämnet penetrerar cellmembranet. Efter lufttorkning ses ofärgade celler mot en mörk bakgrund.

Direkt färgning

Cellerna färgas in med ett basiskt färgämne efter någon minut kan bakterier studeras.

Gramfärgning

Hans Christian Gram (1853 - 1938) uppfann färgmetoden 1884 & utvecklade den för att kunna påvisa förekoms av bakterier i djurvävnad. I färgningen tillsätss först ett basiskt färgämne (kristallviolett) sedan tillsäts en jod-jodkaliumlösning (lugols-lösning som uppfanns 1835 av franske läkaren Sean Lugol (1786-1851)).

Kristallviolett & lugolslösning bildar ett stort violett komplex. Bakterierna (G⁺) måste vara unga då förmågan att bilda färgkomplexet förloras med åldern.

Vid tvätt med etanol löses lipider upp G^- yttre membran förstörs & färgkomplexet extraheras ut. G⁺ Bakteriers cellvägg dehydreras vilket leder till minskad porstorlek i cellhöljet vilket leder till mer komakt cellvägg=> extraktion av färgämnet motverkas. De G^- bakterierna färgas sedan in med ett annat färgämne (safranin = röd)

Bakterier G⁺

Lactobacillus

Streptococus

Bakterier G^-

Enterobacter

Salmonella

Pseudomonas

Mykoplasma

Ingen cellvägg

Orsakar lunginflammation

Lagfas

1. Vid ympning tar det en stund innan delning börjar.

Accelerationsfas

2. Ökande antal celler

Logfas

3. Cellerna delar dig med konstant hastighet då förhållanderna är optimala.

Retardationsfas

4. Näringsbrist börjar påverka celldelning så den avtar. Ansamling av toxiska avfallsprodukter kan påverka.

Stationärfas

5. Maximala antalet celler är nått. Balans mellan tillväxt & avdödning.

Deklinationsfas

6. Fler bakterier dör än som bildas. Antalet levande celler i lösningen minskar.

Bakteriers tillväxt

Styrs av olika faktorer i omgivningen (näring, salthalt, pH, temperatur, syretillgång).

Förökning genom delning

Bakterien når en viss storlek replikeras kromosomen & sedan sker delning. Snabbväxande bakterier kan dela sig var 20:e minut vid gynsamma förhållanden.

Robert Koch

1840-1910

Upptäckte att sjukdomar orsakas av bakterier.

Medel mot bakterier.

Tuberkelbacillen vilket orsakar tuberkulos.

Joseph Lister

1830-1910

Antiseptiska metoder för sårbehandling (Döda bakterier).

Använde Pasteurs teorier om mikroorganismers roll vid smittoöverföring genom att införa tvättning av sår med karbolsyra. Minskade dödsfallen från 45% till 15%.

Girolamo Fracastoro

1480-1550

Teori kring spridning av sjukdomar

Spekulation hur sjukdomar överförs via människor.

Folk som umgicks med sjuka blev sjuka.

Små partiklar spred sjukdomar mellan människor.

Bakteriers uppbyggnad & innehåll

70 % vatten

22% makromolekyler

Innehåller: Kol, Syre, Väte, Kväve, Fosfor & Svavel vilket används för att bygga monomerer som blir polymerer (makromolekyler).

Behöver mineraler: kalium, Kalcium, järn, zink

Kolkälla, energikälla, elektronkälla

Kolkälla

2 kat beroende på kol

Autotrof använder koldioxid

Hetrotrof anävnder organiska molekyler ex fett, glukos & aminosyra

Autotrof

Kolkälla

Använder sig av koldioxid

Hetrotrof

Kolkälla

Använder organiska molekyler

ex glukos, aminosyra, fett

Energikälla

2 kat beroende på energi

Fotofrof - ljus

Kemotrof - oxiderar organiska och oorganiska ämnen.

Fototrof

Energikälla

Anävnder sig av ljus

Kemotrof

Energikälla

Oxiderar organiska & oorgansika ämnen

Elektronkälla

2 kat beroende på Elektronkälla

Litotrof - reducerade oorganiska molekyler

Organotrof - organsika molekyler

Litotrof

Elektronkälla

använder reducerade oorganiska molekyler

Organotrof

Elektronkälla

Organiska molekyler

Abiotiska faktorer för bakterier

Rätt: pH, salthalt, temperatur, vattenpotential & syretillgång

Temperatur

-10 - 110

Minimumtemperatur begränsar tillväxt (låg enxymaktivitet)

Optimumtemperatur ger den maximala tillväxten

Maximumtemperatur begränsar tillväxt (enzymerna inaktiveras)

Psykofil

-10 - 20

Mesofil

15-40

Optimipunkt 37

Termofil

40-80

Hypertermofil

70-95

pH

Optimalt 6,5-7,5 men vissa trivs till 1

Salthalt

Olika salthalter

Aerob

Normal syrehalt = 20%

Mikroaerofila

Lägre än 20% syrehalt

Fakulativt anaerob

Beroende på tillgång till syre

Med syre används syrgas som elektronacceptor

Utan syre används organiska ämnen som elektronacceptor

Anaerob

Utan syre

Aerotolerant

överlver lågsyrehalt men använder inte syre

Obligat anaerob

tål inget syre alls

Komplexa medier

Ej känd sammansättning men iaf vitaminer, aa & mineraler mm, billiga och användarvänliga.

ex näringsbuljong (NB & Näringsagar(NA)

Syntetiska medier

känd sammansättning

Dyra och omständiga

proteiners funktioner

Transportproteiner

Receptorer

Enzymer

Motorprotein

Genreglerandeproteiner

Strukturproteiner

Signalproteiner (hormoner)

Antikroppar

Förrådsproteiner

Proteiners form

Bestämmer dess funktion → Strukturen ändras - funktion ändras

-Polypeptid: fler än 5 aa

-Protein: mer än 40-50 aa

-Aminosyror har olika sidogrupper vilka spelar stor roll för strukturen

Proteiners olika struktur nivåer

Primärstruktur: aa-sekvensen

Sekundärstruktur

Tertiärstruktur

Kvartärstruktur

Primärstruktur

Aminosyresekvensen

Sekundärstruktur

Pga -NHgrupper & C=Ogrupper som sticker ut från proteinet kan vätebindningar uppstå där dessa kommer nära varandra. Leder till 2 olika strukturer:

α-helix (spiral)

β-struktur (aa-kedjan löper parallelt/antiparallelt så kedjan veckas ihop)

Tertiärstruktur

3D struktur som bildas genom:

vdW-bindning, vätebindning, dipol-dipolbindning, disulfidbruggor & jonbindning

Aminosyror som tidigare var långt ifrån varandra binds ihop. Detta beror på aminosyrornas sidokedjor.

Negativt laddade sidokedjor riktas mo positivt laddade sidokedjor.

Opolära sidokedjor riktas mot varandra.

Polära sidokedjor riktas mot varandra.

Chaperoner

Chaperoner är proteiner som kan skydda andra proteriner från att denatureras alltså brytas ner.

Chaperoner hjälper även till vid protein-veckningen så att rätt bindningar bildas.

Följande kan leda till förstörd tertiärstrucktur:

Ändrad temperatur, ändrad salthalt, ändrat pH

Kvartärstrucktur

Finns endas hos proteiner som består av fler än 1 polypeptid. Kan hållas ihop med samma typ av bindningar som tertiärstrukturen.

Genöverföring

Främmande gener sätt in i cell

Att rena DNA

Cellmembranet bryts ner med enzymer, detergenter eller mekanisk påverkan

Proteiner och andra cellkomponenter avlägsnas. Görs med hydrofobt ämne ex kloroform

DNA fälls ut, görs med tillsats av NaCl och etanol

Verktyg som behövs för kloning/genöverföring/modifiering 6st

Framrening av DNA

PCR

Vektorer

Restriktionsenzymer

DNA ligas

Kromatografi

PCR - uppfan, behövs

Kary B Mullis 1985 nb 1993

Används för att masskopiera/klona DNA

Endast några få celler DNA behövs från början

Liknar replikationen men kan användas på mer specifika sekvenser

Det som behövs:

DNA - Fragment som ska klonas

Primers 2st - ca 20 baspar långa, komplementära till de 2 DNA-strängarna

DNA-polymeras (taq-polymeras) - Polymeras som klarar höga temperaturer

DNA-nukleotider - Byggsterna till DNA-molekyler

Buffertlösning - För att alla förhållanden ska vara perfekta för komponenterna.

PCR-maskin -hur

En maskin som ändrar temperaturen för att få reaktionerna att ske.

En cykel innebär att:

1.Vätskan värms till 95 (strängarna separeras)

2.Temperaturen sänks till 53 och primers binder in.

3.Vätskan värms till 72 och taq polymeras binder in och syntetiserar ny sträng.

Tident för de olika stegen kan varieras, speciellt steg 3 (beroner på hur lång bit som ska syntetiseras)