🌱🦠 Mikrobiologia - 🔬🧫 Laby - 🔬💡 Mikroskopowanie cz. 1

🦠📏 Kilka mikrometrów.

🦁💬 Wymiary te leżą daleko poza granicą zdolności rozdzielczej nieuzbrojonego oka ludzkiego.

❓🔬 Jaką wielkość mają najczęściej komórki prokariotyczne, co wymusza stosowanie mikroskopów?

🧬📉 W nanometrach.

🦁💬 Są one jeszcze mniejsze od bakterii.

❓📏 W jakich jednostkach mierzy się zwykle wirusy?

🔦⚡ Wiązka światła (przeważnie widzialnego lub UV).

🦁💬 W mikroskopach elektronowych wykorzystuje się wiązkę elektronów.

❓💡 Jaki czynnik fizyczny wykorzystuje się do uzyskiwania obrazu w mikroskopach optycznych?

📐👀 Oś optyczna.

🦁💬 Wzajemne odległości między źródłem:

• 💡 światła;

• 🗜 kolektorem;

• 💪 kondensorem;

• 🧫 preparatem;

• 📷 obiektywem;

• 🔍 okularami;

muszą być precyzyjnie dobrane, a ich środki muszą leżeć na jednej linii.

❓🎯 Na jakiej linii muszą leżeć wszystkie elementy optyczne w prawidłowo wyregulowanym mikroskopie?

🕯⚙ System Koehlera.

🦁💬 Jest to powszechnie przyjęty, praktyczny i łatwy system regulacji oświetlenia mikroskopu.

❓🔧 Jak nazywa się system regulacji oświetlenia stosowany w mikroskopach w celu uzyskania optymalnego obrazu?

↔🔍 Zdolność rozdzielcza (d).

🦁💬 Oznacza ona minimalną odległość między dwoma punktami obserwowanego przedmiotu, które w obrazie będą widoczne jako rozłączne.

❓📉 Czym jest parametr d w mikroskopii?

🧮📝Gdzie:

λ – długość fali światła,

n – współczynnik załamania światła,

α – kąt aperturowy obiektywu.

❓📐 Podaj wzór na zdolność rozdzielczą mikroskopu (d) i wyjaśnij symbole.

📉🏆 Im mniejsza wartość d, tym lepsza rozdzielczość.

🦁💬 Oznacza to, że mikroskop potrafi rozróżnić punkty położone bliżej siebie.

❓🤔 Czy dążymy do tego, aby wartość d była jak największa, czy jak najmniejsza?

🌊🔢 Współczynnik załamania światła (n).

💡🫧 Dla powietrza wynosi on ok. 1.

💡🌻 Dla olejku immersyjnego wynosi on ok. 1,5.

❓🧪 Co oznacza symbol n we wzorze na rozdzielczość i ile wynosi dla powietrza oraz olejku immersyjnego?

🔢👁 Apertura numeryczna.

Jest to iloczyn współczynnika załamania światła i sinusa kąta aperturowego (nsinα). Znajduje się w mianowniku wzoru – im jest większa, tym lepsza rozdzielczość.

↔🔍 Zdolność rozdzielcza (d).

Oznacza ona minimalną odległość między dwoma punktami obserwowanego przedmiotu, które w obrazie będą widoczne jako rozłączne (niezlane w jeden punkt).

🌫⬆ Zwiększają współczynnik n.

Dzięki temu zwiększa się mianownik we wzorze (2nsinα), co skutkuje zmniejszeniem wartości d i poprawą rozdzielczości.

❓🛢 Dlaczego stosuje się obiektywy immersyjne (z olejkiem)?

🌈📉 Użycie światła o krótszej fali (λ).

🦁💬 Zmniejszenie licznika we wzorze (np. użycie ultrafioletu) zmniejsza d, poprawiając rozdzielczość.

❓🟣 W jaki sposób zmiana długości fali światła wpływa na poprawę rozdzielczości?

🔢👁 Apertura numeryczna (NA).

🦁💬 Jest to iloczyn współczynnika załamania i sinusa kąta aperturowego (nsinα). Im jest większa, tym lepsza rozdzielczość.

❓🏷 Jak nazywa się wartość wyrażona wzorem nsinα?

📏🛑 0,25 µm (250 nm).

🦁💬 Pozwalają na to najlepsze współcześnie produkowane obiektywy.

❓🚧 Jaka jest graniczna rozdzielczość (minimalne d) osiągalna dla mikroskopów optycznych?

🔦📉 2/3 apertury obiektywu.

🦁💬 Gdy apertura kondensora jest zbyt duża, jakość obrazu pogarsza się ze względu na odbicia wewnętrzne i rozproszenie światła.

❓💡 Jaka powinna być apertura numeryczna kondensora w stosunku do apertury obiektywu, aby uzyskać najlepszy obraz?

↔🔍 Zdolność rozdzielcza (d).

Oznacza ona minimalną odległość między dwoma punktami obserwowanego przedmiotu, które w obrazie będą widoczne jako rozłączne (niezlane w jeden punkt).

❓📉 Czym jest zdolność rozdzielcza mikroskopu?

💡🌐 Cały preparat.

W mikroskopii szerokiego pola oświetlany jest cały preparat, a jego elementy pochłaniają, odbijają światło lub fluoryzują.

❓🔬 Jaka część preparatu jest oświetlana w tzw. zwykłej mikroskopii optycznej (szerokiego pola)?

👁🦠 Jasne pole, ciemne pole, kontrast fazowy i fluorescencja.

❓📝 Jakie cztery techniki wymienia się jako podstawowe do obserwacji mikroorganizmów?

🔫🍰 Mikroskop konfokalny.

Charakteryzuje się on małą głębią ostrości (obraz powstaje prawie wyłącznie z punktów w płaszczyźnie ogniskowania), co pozwala na uzyskiwanie „przekrojów optycznych”. Wykorzystuje wiązkę lasera.

❓🔬 Jaki rodzaj mikroskopu wykorzystuje skanującą wiązkę lasera i pozwala na uzyskanie obrazu z bardzo wąskiej płaszczyzny (przekroju)?

🌓🧛 Różnica pochłaniania (odbijania) światła.

Metoda ta bazuje na tym, że różne elementy preparatu w różnym stopniu pochłaniają lub odbijają światło oświetlające.

❓🎨 Na jakiej fizycznej różnicy bazuje powstawanie obrazu w technice jasnego pola?

🔦📐 Oświetlenie skośne.

Polega na oświetleniu preparatu pod kątem. Pozwala to na poprawę widoczności drobnych struktur i polepszenie kontrastu obiektów słabo pochłaniających światło (np. niebarwionych bakterii).

❓📉 Jaka modyfikacja sposobu działania mikroskopu w trybie jasnego pola pozwala znacznie poprawić kontrast niebarwionych obiektów?

🆙👀 Dwukrotnie lepszą zdolność rozdzielczą

oraz lepszy kontrast w obrazie.

❓🚀 Jaki zysk w jakości obrazu (rozdzielczości) można uzyskać stosując oświetlenie skośne?

🖐🔧 Odchylenie oprawki przysłony aperturowej (lekko w bok)

lub zastosowanie amatorskich rozwiązań (opisanych w Internecie).

❓🛠 W jaki prosty sposób można uzyskać efekt oświetlenia skośnego w mikroskopie?

🔦⚫ Pustym wewnątrz stożkiem światła.

Jest on utworzony przez kondensor o specjalnej konstrukcji.

❓🔺 W jaki sposób oświetlany jest preparat w technice ciemnego pola?

🚫👁 Nie wpada w ogóle.

Dzięki temu tło pozostaje czarne. Do obiektywu trafia tylko światło odbite lub rozproszone na elementach preparatu (które świecą na ciemnym tle).

❓💡 Czy przy braku obiektów w preparacie światło z kondensora ciemnego pola wpada do obiektywu?

⚙🔬 Wymaga bardzo wyspecjalizowanego kondensora.

Kondensor ten musi mieć możliwość precyzyjnego dopasowania swojej apertury do apertury obiektywu (za pomocą przysłony irysowej), co jest trudne przy dużych powiększeniach (40x–100x).

❓📉 Dlaczego technika ciemnego pola jest obecnie rzadko stosowana w bakteriologii przy dużych powiększeniach?

✨🔦 Ultramikroskopia.

Pozwala ona na obrazowanie obiektów o rozmiarach mniejszych niż zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego (nawet ok. 0,04 µm, np. wirusy).

❓🔬 Jak nazywa się modyfikacja metody ciemnego pola wykorzystująca silne oświetlenie boczne do wykrywania bardzo małych obiektów?

📉🌟 Około 0,1 µm.

(W tekście pada zakres zbliżony do 0,04 µm, a w silnym oświetleniu bocznym widoczne są obiekty 0,1 µm).

❓📏 Jakiej wielkości obiekty (np. wirusy) jest w stanie zarejestrować ultramikroskop?

🛑🧐 Nie.

Zdolność rozdzielcza (możliwość rozróżnienia dwóch punktów) pozostaje bez zmian (ok. 0,25 µm). Ultramikroskopia pozwala jedynie zarejestrować obecność małych obiektów jako jasnych punktów (nie widać ich kształtu/szczegółów).

❓🤔 Czy ultramikroskopia zwiększa dwupunktową zdolność rozdzielczą mikroskopu (poniżej 0,25 µm)?

👨‍🔬🏅 Frits Zernike (w 1932 roku).

Otrzymał za to Nagrodę Nobla w 1953 roku.

❓📜 Kto wynalazł mikroskop kontrastowo-fazowy i kiedy został za to uhonorowany Nagrodą Nobla?

🌊➡💡 Różnic fazowych w różnice natężenia.

Technika ta przekształca drobne różnice fazowe światła (niewidoczne dla oka) przechodzącego przez preparat w znaczne różnice natężenia światła (kontrast) w obrazie.

❓🔭 Na czym polega istota techniki kontrastu fazowego (co w co jest przekształcane)?

🦠👻 Prawie wcale nie pochłaniają światła.

Ich obecność w preparacie powoduje jedynie niewielkie przesunięcie fazy światła, co jest niewidoczne dla oka w mikroskopie jasnego pola.

❓🔬 Dlaczego żywe komórki bakterii są słabo widoczne w zwykłym mikroskopie (bez barwienia)?

🧪🚫 Obserwacja przyżyciowa.

Umożliwia oglądanie mikroorganizmów bez zabijania ich i bez żadnej ingerencji chemicznej (barwienia).

❓✅ Jaka jest główna zaleta mikroskopii kontrastowo-fazowej w badaniu drobnoustrojów?

⚡🌊 Interferencja dwóch wiązek.

Kontrast powstaje w wyniku interferencji (nakładania się) wiązki światła ugiętego na obiekcie (komórkach) i wiązki światła bezpośredniego (przechodzącego przez tło).

❓🌈 Jakie zjawisko fizyczne leży u podstaw powstawania kontrastu w tej metodzie?

⚙🔘 Przysłona pierścieniowa.

Wytwarza ona stożkowatą wiązkę światła skupioną na preparacie.

❓🔦 Jaki element wprowadza się do kondensora w mikroskopie kontrastowo-fazowym?

🔘👀 Pierścień fazowy.

Jego zadaniem jest wprowadzenie dodatkowego przesunięcia fazowego (o +/- 90 stopni) do światła bezpośredniego oraz osłabienie jego natężenia.

❓🔭 Jaki element znajduje się wewnątrz obiektywu mikroskopu kontrastowo-fazowego i jaka jest jego rola?

🔧🎯 Mikroskop pomocniczy.

Służy on do wycentrowania obrazów przysłony pierścieniowej i pierścienia fazowego (muszą się idealnie pokrywać).

❓🛠 Czego używa się do prawidłowego wyregulowania (centrowania) układu optycznego w tej metodzie?

💧🧬 Refraktometria imersyjna.

Polega na dobraniu cieczy o współczynniku załamania zbliżonym do cytoplazmy komórki, co pozwala uwidocznić struktury wewnętrzne (np. nukleoidy) dzięki subtelnym różnicom w załamywaniu światła.

❓🧪 Jaka technika łącząca kontrast fazowy z odpowiednimi płynami pozwala na wizualizację wnętrza komórki (np. nukleoidów)?

🌈⚡ Emisja światła po wzbudzeniu.

Polega na emisji światła przez cząsteczki chemiczne, które zostały wcześniej wzbudzone światłem o innej, z reguły mniejszej długości fali.

❓🔬 Na czym polega zjawisko fluorescencji wykorzystywane w mikroskopii?

🏷🧪 Sondy znakowane fluorescencyjnie (fluorochromy).

Umożliwiają one wybiórcze znakowanie i obserwację konkretnych struktur wewnątrzkomórkowych.

❓🧬 Co stanowiło przełom w mikroskopii biologicznej i służy do uwidaczniania elementów komórki w tej technice?

🌿🟢 Tak.

Niektóre związki wykazują naturalną zdolność do fluorescencji, np. chlorofile.

❓🍃 Czy komórki mogą fluoryzować naturalnie (bez barwienia)? Podaj przykład.

🔵➡🟢 Pochłania niebieskie, emituje zielone.

Maksimum absorpcji: 494 nm (niebieskie).

Maksimum emisji: 521 nm (zielone).

❓🎨 Jakie światło pochłania, a jakie emituje fluoresceina (podaj kolory i przybliżone długości fal)?

😎🛑 Filtry interferencyjne.

Ich zadaniem jest odcięcie fali świetlnej użytej do wzbudzenia (np. niebieskiej), a przepuszczenie tylko promieniowania wyemitowanego przez próbkę (np. zielonego).

❓🛡 Jaki element optyczny jest niezbędny, aby oddzielić światło wzbudzające od emitowanego i zobaczyć obraz?

⚫✨ Świecące obiekty na czarnym tle.

(Np. zielone cząsteczki fluoresceiny na czarnym tle rozciągającym się w obszarach preparatu, gdzie nie ma barwnika).

❓👀 Jak wygląda typowy obraz w mikroskopie fluorescencyjnym?

💡🔬 Epifluorescencja.

Oznacza to, że światło z oświetlacza (np. lampy rtęciowej) pada na preparat przez obiektyw mikroskopu (od góry), a tą samą drogą wraca światło wyemitowane przez obiekt.

❓🔦 W jakim trybie pracują prawie wyłącznie mikroskopy fluorescencyjne i jak pada w nich światło na preparat?

🔢🎨 Od 2 do 4.

Pozwala to na obserwowanie różnych struktur komórkowych (różne typy komórek) na jednym obrazie, o ile barwniki emitują światło o charakterystycznej, odmiennej barwie.

❓🌈 Ile różnych fluorochromów można stosować jednocześnie w typowych mikroskopach fluorescencyjnych?

👨‍🔬🗓 Marvin Minsky w 1955 roku.

❓📜 Kto i kiedy skonstruował pierwszy mikroskop konfokalny?

🌫🚫 Wyeliminowanie światła pochodzącego spoza płaszczyzny ogniskowania.

Dzięki temu obraz punktów leżących poza ostrością nie jest nieostry, lecz w ogóle nie dociera do detektora.

❓💡 Jaki był rewolucyjny pomysł leżący u podstaw mikroskopii konfokalnej, odróżniający ją od klasycznej fluorescencji?

🔦🎯 Punktowo.

Wiązka światła (lasera) jest skupiana w punkcie leżącym na płaszczyźnie ogniskowania (obrazowej).

❓🔬 W jaki sposób oświetlany jest obiekt w mikroskopie konfokalnym?

🕳🛑 Przysłona konfokalna (ang. pinhole).

Znajduje się ona tuż przed detektorem i działa jak filtr przestrzenny, przepuszczając tylko światło z płaszczyzny ostrości.

❓⚙ Jaki element konstrukcyjny jest kluczowy dla odcięcia światła nieostrego i gdzie się znajduje?

🔫🌈 Lasery światła widzialnego (zakres 400–700 nm).

Zastępują one lampę rtęciową stosowaną w zwykłych mikroskopach fluorescencyjnych.

❓⚡ Co stanowi źródło światła w mikroskopie konfokalnym?

📉📸 Skanowanie punkt po punkcie.

Wiązka lasera omiata preparat linia po linii, a obraz całego preparatu jest składany cyfrowo z pojedynczych punktów.

❓🔄 W jaki sposób uzyskuje się obraz całego preparatu, skoro oświetlenie jest punktowe?

📡📈 Fotopowielacz.

Jest to bardzo czuły detektor fotonów.

❓👁 Co służy do detekcji światła w mikroskopie konfokalnym?

📐🍰 Przekroje optyczne.

Dzięki odcięciu tła mikroskop tworzy bardzo cienkie, ostre obrazy z wnętrza preparatu, co pozwala na późniejszą rekonstrukcję trójwymiarową (3D).

❓🧊 Jaki rodzaj obrazów umożliwiających ocenę geometrii przestrzennej uzyskuje się tą techniką?

📉📏 W osi Z (głębia) jest gorsza.

Rozdzielczość w płaszczyźnie ogniskowania (XY) jest około dwukrotnie większa (lepsza) niż wzdłuż osi optycznej (Z). Obiekty są bardziej "rozciągnięte" w pionie.

❓🤔 Jak ma się rozdzielczość w płaszczyźnie ogniskowania do rozdzielczości w głąb preparatu (oś Z)?