BIM vizsga

BME Biomérki műveletek és folyamatok 2024/2025 tavaszi félév.

Biotechnológia előnyei

Enyhe reakciókörülmények

Megújuló alapanyagok

Olcsóbb és könnyen beszerezhető alapanyagok

Kevésbé veszélyes

Kisebb környezeti ártalom

Biokatalizátorok specifikussága

Sokoldalú, többcélú, de egyszerűbb készülékek (olcsóbb)

Kisebb energiaigény, de nagyobb hozam

rDNS technológiák lehetőségei

Biotechnológia

Természet tudományok alkalmazása az élő szervezetek technológiai felhasználásának céljából

Ereky Károly (1917) használta először a kifejezést

Biotechnológia használata

Komplex molekulák előállítása

Célzott előállítás izomereknél

Tenyészet több reakcióra is képes egyszerre

Nagyobb hozamot ígér

Biotechnológia hátrányai

Alacsony produktivitás kémiaival szemben

Híg oldatos termékek kinyerése drága és bonyolult

Magas BOI szennyvíz (de könnyen tisztítható)

Fertőzés veszély

Kétoldali változékonyság: alapanyagok minősége és a mikrobák

Idegenkedés, elutasítás (pl. GMO, mikrobák)

Enzimek funkciója

Csökkentik az aktiválási energiát

Aktiválási energia

Legkisebb szükséges energiamennyiség a reakció végbemeneteléhez

Biokatalízis

Nukleinsav világ

Ribozimek —» katalizáló RNS; önkatalizációra is képes lehetett

Lassan kifejlődtek a fehérjék

Maradtak: ATP, NAD⁺, CoA, tRNS, UDP templát, RNaseP

Szubsztrát

Az enzimes reakcióban átalakuló molekula

Szelektív a megkötődés

Kötőhely

Az enzimnek az a felülete ahová a szubsztrát megkötődik (több hely is lehet)

Enzim és Szubsztrát közötti kölcsönhatások

Másodlagos kölcsönhatások lépnek fel a kettő között

Ionpár, Hidrogén híd, van der Waals (hidrofób)

Aktív centrum

Az átalakításért felelős régió az enzimen

Enzimes reakciók

Csak termodinmikailag lehetséges reakciókat gyorsítanak

Reverzibilis

Egyensúlyra vezet, de az egyensúly eltolható

Specifikus: szubsztrát, csoport, sztereo, régió, reakció

Szubsztrátspecifitás

Adott enzim csak adott szubsztrátot alakít át

Csoportspecifitás

Az enzim olyan szubsztrátokat alakít át, amelyek adott típusú kémiai funkciós csoportot tartalmaznak vagy adott típusú csoportot hoznak létre

Reakcióspecifitás

Az enzimek csak bizonyos típusú kémiai reakciókat tudnak katalizálni

Sztereospecifitás

Az enzim csak egy adott térbeli formájú szubsztrátot tud felismerni és átalakítani

Régióspecifitás

Az enzim csak bizonyos helyzetben lévő funkciós csoportokat alakít át

Enzimek elnevezése

Szubsztrát szerint - pl. ureáz

Szubsztrát és reakció után - pl. alkohol-dehidrogenáz

Triviális - pl. pepszin, tripszin, rennin (fehérjebontók, -in végződés)

Szisztematikus - katalógus

Királis centrum

Olyan C-atom, amelyhez négy eltérő csoport kapcsolódik

Holoenzim

A teljes enzim

Apoenzim és kofaktor együttese

Apoenzim

Az enzim fehérje része

Kofaktor

Az apoenzimhez kapcsolódó nem fehérje molekula

Típusai:

• fémion

• szerves molekula=koenzim

Koenzim

Kofaktor szerves molekula

Típusai:

• prosztetikus csoport - kovalensen kötődik a fehérjéhez (pl. FADH₂)

• koszubsztrátok - pl. NAD(H), ATP

Enzimes reakciók sémája

Enzimek mennyisége

Enzimpreparátum sohasem tiszta —» Mennyiséget hatásuk alapján kapjuk

Unit [U]= az az enzim mennyiség, amely 1 µmol szubsztrátot alakít át 1 perc alatt adott reakciókörülmények között

Katal (SI)= 1 katal 1 mol szubsztrátot alakít át 1 perc alatt

nanoKatal praktikusabb: 1 U=16,67 nK (1 nK=10^-9 Kat)

Rapid ekvilibrium

k₁SE=k_-1(ES)

Michaelis-Menten séma

Feltételezések:

• k_-2=0 (második lépés irreverzibilis)

• rapid ekvilibrium

• egy aktív centrum, egy szubsztrát

• aktivitás helyett koncentráció használható

Enzim-szubsztrátum disszociációs állandója

Michaelis-Menten sebesség egyenlet

Briggs-Haldane kinetika

Ugyanazok a differenciálegyenletek, de a feltételezés: Kvázi állandósult állapot

Rövid átmeneti szakasz —» Nagyon lassú változás

(Pre-steady state) (Kvázi-steady state)

Michaelis állandó

Diszkusszió

Paraméterbecslés

Lineweaver-Burk linearizálás

Hanes-Langmuir linearizálás

Eady-Hofstee linearizálás

Kinetikai paraméterek

v_max —» határsebesség

k₂ —» váltásszám

k_cat —» S-telítés esetén E-molekula átalakítási frekvenciája

K_s, K_m —» enzim affinitása a szubsztráthoz

Fajlagos aktivitás és Váltásszám

Haldane-féle összefüggés

Michaelis-Menten reverzibilis egyenlet

Enzim aktivitást befolyásoló tényezők

További kötőhelyek

Fehérje kovalens módosítása

További kötőhelyek

Fémionok - ionos és kelát forma

Modulátor molekulák - inhibitor, aktivátor

Fehérje kovalens módosítása

Foszforilezés, Glikolizálás, Proteolízis

Komplett inhibíció

Az enzim elveszíti az aktivitását

Lineáris inhibíció

Részleges inhibíció

Az aktivitás csak csökken, egy része megmarad

Hiperbolikus inhibíció

Inhibíció - Aktiválás mértéke

Irreverzibilis inhibitorok

Jelentősen csökkentik vagy teljesen gátolják az enzim aktivitását.

Visszafordíthatatlan

pl. nehézfémek, cianid, idegmérgek - enzimmérgek

Reverzibilis inhibitorok

Dinamikus komplexet képeznek az enzimmel

Katalitikus hatása eltér a nem komplexálódott enzimekétől

K_m és v_max-ra kifejtett hatása alpján csoportosítjuk őket.

• Kompetitív - növeli a K_m értékét, a v_max nem változik

• Nemkompetitív - csökkenti a v_max értékét, a K_m nem változik

• Unkompetitív - v_max és K_m arányosan csökken

• Kevert - előbbiek keveréke

Kompetitív inhibíció

S és I kölcsönösen kizárják egymást az enzimről

pl. alternatív szubsztrát, szubsztrát analóg, termék

Klasszikus gátlás

A S és I versengenek az aktív centrumért

Sztérikus gátlás A

I kötődése másik kötőhelyhez térbelileg gátolja a S kötődését

Sztérikus gátlás B

I és S analóg része verseng egy közös kötőhelyért

Átlapoló gátlás

Kizárják a másikat a kötőhelyéről, ha kötődnek a sajátjukhoz

Közvetett gátlás

I kötődése az enzimhez konformáció változáshoz vezet, ami miatt a S nem tud kötődni

pl. végtermék gátlás

NemKompetitív inhibíció

Az I egy másik kötőhelyhez kapcsolódik, csak térben gátolja a szubsztrát kötődését, egymástól függetlenek

Nincs affinitás vagy térszerkezet változás

Rapid ekvilibrium - K_s=K_m

pl. H-ionok, (nehéz fémek, cianidok)

Unkompetitív inhibíció

Az I a már létrejött ES komplexhez kötődik —» kötőhely eltorzul

inaktív ESI komplex —» nincs termék

Kevert típusú inhibíció

Kinetikai levezetése megegyezik a nemkompetitívval, de az I változtathat az affinitáson

[ESI]⍺ - új alpha tényező

Szubsztrát inhibíció

S-nek két vagy több helyen kellhet a E-hez kötődni termékképzéshez

• nagy [S] esetén a S nem az AC-hoz kapcsolódik - nemkomp v. un

• S elvonja az aktivátor molekulát

• Több S reakcióknál az egyik feleslege leköti a másik kötőhelyeit

• Aspecifikus módok - pl. ionerősség növekedése

DIXON linearizálás

Azonos S értékekhez tartozó sebesség értékeket vizsgáljuk

• egyenest adnak = reakció lineáris; elhelyezkedésükből beazonosíthatjuk az I típusát és kinetikai konstansait

Többszubsztrátos reakciók típusai

Egyszerre több különböző S kell a P képzéshez - pl. hexokináz

Több hasonló, alternatív S van jelen - pl. amiláz, celluláz, proteináz

Bi-Bi reakciók

=mind S min P oldalról bimolekuláris

Típusai: random, határozott, ping-pong mechanizmus

Random bi-bi reakciók

Hasonlít a lineáris kevert inhibícióra, a komplexet EAB-nek nevezzük

Határozott sorrendű bi-bi reakciók

Hasonlít az unkompetitív inhibícióhoz, néha a B csak az A után tud kapcsolódni

EAB —» EPQ lépés sebessége a meghatározó tényező

Ping-pong mechanizmus

Az enzim két stabil módosulat között oszcillál

1. EA «—» EP

2. P leválik

3. AB «—» EQ

4. Q leválik

Alternatív szubsztrátok

Sok enzim több S-t is képes átalakítani —» kompetíció

• Polimerek monomerjeit összekapcsoló kötések úgy viselkednek, mit egy-egy szubsztrát

• Különböző lánchosszúságú polimerek keverékei

• Hidrolitikus enzimek

  • exo-hidroláz - láncvégi kötéseket bont

  • endo-hidroláz - láncon belüli kötéseket bont

pH hatása enzimaktivitásra

az oldalláncok + és - töltésűek «— a töltés disszociáción keresztül függ

Hőmérséklet hatása enzimaktivitásra

Pozitív - reakciósebesség nő

Negatív - denaturálódás

• irreverzibilis

• reverzibilis

Egyéb hatások enzimaktivitásra

ionerősség, nyírás, hidrosztatikai nyomás, felületi feszültség, vegyszerek, fény, hang, ionizáló sugárzások

Heterogén fázisú enzimreakciók előnyei

Homogén rendszer

Nem igényel előkészítést

Heterogén fázisú enzimreakciók hátrányai

Enzimek drágák

Egyszeri felhasználás

Kinyerésük bonyolult és drága

Szennyezik a terméket, tisztítását nehezítik

Immobilizáció története

Nelson és Griffin - élesztő invertáza aktív szénen abszorbeálódott és nem vesztette el az aktivitását

Grubhofer és Schleith - egy sor enzimet rögzítettek poli-aminosztirol gyantára

Chibata - aminoacilázt DEAE Sephadexre rögzítette és L-aminosav rezolválására használták

Enzim rögzítés módszerei

Fizikai - Kémiai

Hordozóhoz - Önmagához - Bezárás

Adszorpció

Fizikai módszer

pl. Ioncserélők

Egyszerű, regenerálható

Az enzim könnyen leválhat

Egyéb anyagokat is adszorbeálhat; nem specifikus

Alginát gélbe zárás

Fizikai módszer

Enzim tartalmú pufferoldatot Na-algináttal keverik össze

Az oldatot lassan, kis cseppekben Ca²⁺-ionokat tartalmazó pufferbe csepegtetik

A Ca²⁺ és Na⁺ ionok kicserélődnek

Ca-alginát golyók körbezárják az enzimet, vízben nem oldható —» fenn kell tartani a Ca-koncentrációt vagy feloldódnak (frissen kell készíteni)

Gasztronómia - szájban olvadó kaviár tetszőleges folyadékkel töltve

Ehhez hasonló: kitozán, karragén

Akrilamid gélbe zárás

Fizikai módszer

A monomert az enzim, K₂S₂O₈ polimerizáció-iniciátor és β-dimetilamino-propionitril gyorsító jelenlétében polimerizálják

100-400 nm pórusátmérőjű polimerszemcsék keletkeznek

Élelmiszeriparban nem lehet használni - mérgező

Mikrokapszulázás

Fizikai módszer

300µm, féligáteresztő membránú kapszulákba zárják az enzimeket

Állandó polimer membránú mikrokapszula

Fizikai módszer

Enzim jelenlétében két monomert polimerizálnak - egyik nem vízoldható, a másik igen és a szerves fázisban is oldódik

Az oldatot keveréssel diszpergálják a szerves fázisban

Potenciálkülönbség miatt diffúzió indul meg, a diffundáló monomerek a cseppek határfelületén találkoznak —» kopolimerizáció

Vékony polimer héj alakul ki az enzim körül

Nem állandó membrános koacervátum

Fizikai módszer

Vizes enzimoldat emulgeálása felület aktív anyag jelenlétében

Hatalmas felület képződik

Több enzim is bezárható egy kapszulába

A membrán diffúziós gátat jelent a terméknek és a szubsztrátnak

Nagy reakciósebesség érhető el

Ultraszűrő membránba zárás

Fizikai módszer

Makro-módszer

Egy féligáteresztő membránnal elválasztjuk az enzimoldatot és a szubsztrátot

Hollow fibre/Üreges szálú szűrőelemeket kedvelik az enzimes technológiákban

Hordozóhoz rögzítés

Egy vízoldhatatlan hordozót és funkciós csoportjainak aktiválása

Kovalens kötés kialakítása az enzim és a hordozó között

Hordozó lehet:

• természetes polimer: pl. agar, agaróz, kitin, cellulóz, kollagén

• szintetikus polimer: pl. poliuretán, polisztirol, nylon

• szervetlen: pl. üveg, alumínium, szilikagél, magnetit

Diazotálás

A hordozó primer aminocsoportokat tartalmaz (-NH₂)

Aktiválás során az aminocsoport nitrózus savval (HNO₂) reagál, így diazóniumsó keletkezik

Ezután a mátrix reagál az enzimmel kovalens kötést kialakítva

Hordozók: p-NH₂-benzil-cellulóz, p-NH₂-benzoil-cellulóz, amino-benzoil-SEPHADEX, polisztirol és akrilamid származékok

Keresztkötések

Kötés kialakítása kettő enzim között

Többfunkciós vegyületeket használnak (pl. glutaráldehid)

Molekula méret megnő

Vízoldhatatlan, géles részecskéket hoznak létre

Ipari felhasználásra nem alkalmasak, ezért gyakran adszorbeáltatják az enzimeket, és csak ezután hoznak létre keresztkötéseket

Bifunkciós molekulák

Két reaktív csoporttal rendelkező molekulák

Hordozóhoz kötésnél és Keresztkötésnél használatosak

CLEC

=crosslinked enzyme crystals

Kristályosítható enzimek rögzítése

Jó katalitikus tulajdonságok

CLEA

=crosslinked enzyme aggregates

Az enzimeket (NH₄)₂SO₄-tal vagy butanollal kicsapatunk, és e közben történik a glutáraldehides keresztkötés

Előny: tisztított és nem tisztított enzimekkel is végrehajtható, az enzimaggregátum hőstabilitása nagy, ellenálló, nem oldódnak vízben vagy szerves bázisban

Combi CLEA - több enzim együttes immobilizálása —» vegyes katalizátorok

Sejt immobilizálás

Enzim preparálás nem mindig szükséges

Költség kímélő

Az enzim természetes környezetben működik, védettebb

Természetes koenzim regenerálás lehetséges

Ugyanazok a rögzítési módszerek használtak

Típusai:

• élő sejt rögzítése - koenzimes átalakítások

• nem élő sejt preparátum (permeabilizálás) - egyszerű átalakítások

MAXAFERM eljárás

Többféle enzim és/vagy sejt rögzítése egy preparátumban

Amiloglikozidáz enzim és élesztősejteket rögzítenek

A S dextrin ⍺-amiláz-zal elfolyósíttott keményítő

Az enzim glükózt hidrolizál, amit az élesztő alkohollá erjeszt

Rögzített enzimek kinetikája

Külső anyagátadás

Enzim a hordozó felületére van rögzítve —» Konvektív transzporti és membránon keresztüli diffúziós ellenállás lép fel (1. és 2.)

Paraméterek: k_s, a, S₀, v_max, K_m

Dimenzió mentes paraméterek:

• x= S/S₀

• k= K_s/S₀

• Da (Damköhler-szám)

Belső anyagátadás

Homogén enzim eloszlás az részecske belsejében

Gátolt diffúzió a pórusokban

Külső határréteg transzportja elhanyagolható

Gömbszimmetrikus részecske

Diffúziós állandó:

• D_so - diffúziós állandó a szabad folyadék fázisban

• ε_p - porozitás

• 𝛕 - pórusok kacskaringóssága

• H - hindrance/diffúziógátlás

Oldott enzimek előnyei

Homogén rendszer

Előkészítés nem szükséges

Csak reakció-rezsim van

Oldott enzimek hátrányai

Drágák

Elveszhetnek

Szennyezik a terméket

Csak szakaszos technológia lehetséges

Rögzített enzimek előnyei

Nem szennyezik a terméket

Könnyen elválasztás

Újra felhasználhatóak

Folytonos technológia is lehetséges - könnyű terminálás, stabilabb

Rögzített enzimek hátrányai

Rögzítés költséges

Előkészítés szükséges

Csökken az enzim aktivitása

Diffúziós gát és transzport-rezsim is van

Rögzített enzimek felhasználása

Élelmiszeripar (tejcukor, zsírok, stb.)

Amperometriás oldott oxigén mérő elektród - oxigén termelő/elnyelő enzim

Potenciómetriás pH-mérő - H⁺ termelő/fogyasztó enzim

Bioszenzor

S és/vagy I meghatározása

Marker - pl. ELISA

Hozam számítása

De novo szintézisek

A megfelelő tápoldatban elszaporítva a mikrobák egyszerű tápanyagok segítségével változatos anyagcseretermékeket képesek előállítani

Mivel: mikrobák, növényi sejttenyészet, állati szövettenyészet

pl. fermentációs eljárások

Biotranszformáció

Egy kipreparált enzim katalizátorként alakít át egy vegyületet egy másikká

Enzimekkel - oldott, rögzített

Sejtekkel - növekedő, nyugvó, rögzített, tisztított enzimekkel, fázisrendszerekben, szerves fázisban

Jellemzői:

• általános enzimes reakciók jellemzői (szubsztrát-, reakció-, régió-, sztereospecifikusság )

• enyhe reakciókörülmények

• kirotechnológia

Kirotechnológia

Csökkentik a gyógyszerkémiai szintézisekben keletkező nem hasznos, környezet-szennyező sztereoizomerek mennyiségét

Oxidáció oxigénnel

O₂ - végső elektronakceptor vagy beépül szerves molekulába

Típusai: oxigenáz, monooxigenáz, dioxigenáz

Oxidáció dehidrogénezéssel

Dehidrogenázok végzik

A hidrogéneket redukált koenzimek viszik át

Koenzim szükséglet: NADH, NADPH,FADH₂, Ubikinon, PQQ

Termékek: primer alkoholok, szekunder alkoholok, aldehidek

Ecetsav képződés biokémiája

Primer alkohol

Az enzimek a citoplazma membránba épülnek és itt adják át az ubikinonnak a H⁺-kat.

Az ubikinon visszaoldódik, víz képződik és proton exportálódik a periplazmatikus térbe.

A protonok visszaáramlásával ATP termelődik.

Ipari ecetsav gyártás

Primer alkohol

Törzs: Acetobacter aceti

Orleans-i eljárás - generátor eljárás —» bükkfaforgács felületén biofilm

Frings acetátor - szubmerz eljárás —» O₂, S és P szint kritikus, etanolrátáplálás, erős hőfejlődés