Vectores TDR

Yep

• MCS flanqueado por sitios loxP

• ORI E. coli

• ORI 2 micras → levadura (vector shuttle)

Fagémido

• ORI f1

• ORI E. coli

BAC

• OriS/repE: replicación del factor F (1-2 copias por célula)

• parA y parB: sistema de partición (estabilidad segregativa)

• CmR: resistencia a cloranfenicol

• Promotores T7 y SP6

• LacZ/

Plásmido de 2µm

• Plásmido nuclear

• 50-100 copias por célula

• Formas A y B: inversión de FLP/REP2

  • FLP: FLP recombinasa o flipasa

  • frt: dianas de la recombinación por la flipasa

• Replicación:

  • ORI de 2µm → replicación bidireccional

    REP1, REP2, D → reguladores de la FLP (rolling circle?)

YEP:

• Vector shuttle

  • E. coli: AmpR, TetR (resistencia antibiotico tetraciclina), ORI, MCS

  • Levadura: ORI de 2µm, LEU2 (marcador de selección)

YIp

• Plásmdio sin el ORI de 2µm

• Integración en el cromosoma por recombinación homóloga

• Selección utilizando un marcador auxotrófico (URA3)

YRp

• Plásmido sin el ORI de 2µm

• Secuencias ARS (autonomously replicating sequences)

  • 100pb

  • Origen de replicación cromosomal

• Marcador de selección auxotrófico: TRP1

• Marcador de selección: amp^R (resistencia a ampicilina) y tet^R (resistencia a la teraciclina)

YCps

• ARS (autonomously replicating sequences)

  • 100pb

  • Origen de replicación cromosomal

• CEN: secuencia centromérica que asegura una segregación estable durante la división celular

• TRP1: marcador auxotrófico

• Vector shuttle → ori E. coli + marcador de selección bacteriano

YES vector: yeast expression vector

• Cassette de expresión en levaduras:

  • Promotor PGAL1

  • Terminador CYC1

• Cassette de expresión en E. coli

  • Promotor T7 → tag de histidina

• ORI f1: fagémido → obtener DNA de cadena sencilla

• Si:

  • ORI de 2µm: YEP

  • CEN6/ARSH4: YCP

• Marcador de selección en levaduras:

  • URA3

  • TRP1

• Marcador de selección en E. coli:

  • Resistencia a blasticidina (antibiótico)

  • Resistencia a ampicilina

• ORI E. coli: ORI pUC

Plásmidos Ti desarmados: eliminación de genes oncogénicos y de síntesis de opinas, conservando el T-ADN y los genes vir.

• Vector binario: vector shuttle E. coli/A. tumefaciens, contiene T-ADN modificado con:

  • El gen de interés

  • Los genes marcadores

  • El borde izquierdo y derecho

Ti helper: contiene los genes vir pero sin el T-DNA

Plásmido para transinfectar células animales

Shuttle vector:

• E. coli: ORI, gen de resistencia a la ampicilina,

• Animal: eukaryotic selection marker (ESM) (ble, pac, neo), ORI eucariota animal replicon

Estable y replicativo

Cassette de expresión: promotor, MCS y terminador

Plásmido para transinfectar células animales

• E. coli: ORI, gen de resistencia a la ampicilina,

Transitorio y no replicativo (episomal)

Cassette de expresión: promotor, MCS y terminador

Plásmido para transinfectar células animales

• E. coli: ORI, gen de resistencia a la ampicilina,

• Animal: eukaryotic selection marker (ESM) (ble, pac, neo)

Estable y no replicativo

Cassette de expresión: promotor, MCS y terminador

• MCS

• Promotor CMV

• Gen de resistencia bla (ampicilina) (E. coli)

• Ori E. coli

• Neo: marcador de selección animal (geneticina o G418)

• ORI SV40 → replicación en células COS

• Cassette de expresión animal: promotor CMV, MCS y terminador PA

Plásmido para transfectar células animales, tiene ORI y marcador de selección → replicativo y estable

• Fagémido: ORI filamentoso f1

• ORI pUC → E. coli

• Cassette de expresión: promotor CMV (animal), promotor LAC, MCS, terminador animal SV40

• Cassette de expresión: promotor bla (bacteriano), promotor SV40 (animal), marcador de selección dual (neo/kan, para bacterias y animales), terminador TK pA (animal)

• Vector shuttle

Plásmido para transfección animal no replicativo y estable

• Fagémido: ORI f1

• Gen resistencia a ampicilina

• Cassette de expresión animal: promotor CMV, MCS y terminador hGH poly A

• ORI de E. coli (bacteriano)

• ORI de SV40 (animal)

Plásmido para transfección animal, transitorio replicativo

Vector retroviral: transfer plasmid

• Secuencias long terminal repeats (5’ y 3’) → promotor fuerte, delimitan secuencia

• psi: secuencia importante para el empaquetamiento del virus

• neo: marcador de selección animal

• Promotor CMV: promotor animal → cassette de expresión con el inserto

• ORI de E. coli

• bla: resistencia a ampiciñina