Molekularbiologie Methoden/Experimente

Plasmid-Bluescript

Plasmid mit: lacZ-Gen (codiert beta-Galactosidase), MCS (multi-cloning site) & Gene für Restriktionsenzyme, DNA-Fragment, E. Coli Bakterien

Vorgehensweise:

1. Restriktionsmoleküle: Plasmid in MCS & DNA mit selbem Enzym fragmentieren, sodass komplementärer Überhang entsteht

2. Phosphatase: Plasmid behandeln, damit er sich nicht wieder verbindet (spaltet Phosphat am 5´-Ende ab)

3. Ligase: Plasmid mit DNA-Fragment ligieren

→ lacZ-Gen unterbrochen → weiß (nicht hybridisierte blau)

4. Plasmide in E. Coli einsetzen: Bakterien hungern lassen, mit Ca2+ behandeln & anschließend hitzeschocken

DNA vor Klonierung extrahieren

1. Zellen mechanisch zerkleinern

2. Enzyme: Auflösen der Zellbestandteile

3. Phenol: denaturiert Proteine

4. Abzentrifugieren (Proteine unten), DNA oben in klarer Phase

5. DNA mit Ethanol behandeln → flockt aus

Plasmid nach Klonierung extrahieren

1. E. Coli abzentrifugieren

2. NaOH: denaturiert ALLE Zellbestandteile (inkl. Nukleinsäuren)

3. Essigsäure: Plasmid renaturiert (genomische DNA nicht, weil zerrissen & zu groß, Plasmid durch Supercoiling in Nähe gehalten)

4. alles außer Plasmide flockt aus

Southern Blot

um DNA nachzuweisen

1. DNA-Fragmentieren

2. Elektrophorese auf Agarose

3. DNA auf fixes Medium überführen, parallel mit NaOH denaturieren (einzelsträngig machen)

4. Sonde (radioaktiv markierte cDNA) zugeben, bindet komplementär

5. ungebundene Sonden wegwaschen

6. auf Röntgenfilm legen → Schwärzung der gesuchten Sequenzen

Sonde Herstellung

1. cDNA (ds) denaturieren zu ss

2. Primer hinzugeben

3. DNA-Polymerase hinzugeben

4. dNTP´s anbieten, eines davon (nicht N-ständig) ein radioaktives P32

5. DNA-Pol. füllt ss wieder auf

6. erneut denaturieren

→ ss radioaktiv markierte cDNA

nach Southern Blot

1. markierte DNA aus Agarose herausschneiden (darin aber noch viele (z.B. 50) andere Fragmente)

2. Fragmente zufällig wieder in Bakterien (als Plasmid) oder Phagen überführen wie bei Klonierung

3. kultivieren (Bakterien → Kolonien oder Phagen → auf Bakterienrasen (frisst Löcher)) dabei wird die gesuchte DNA kloniert

4. mit NaOH Bakterien/Phagen platzen lassen

5. mit Sonden behandeln & restliche wegwaschen

6. Röntgenfilm auflegen & eine (gesuchte) Kolonie wird sichtbar

Western Blot

um Proteine nachzuweisen

Sequenzierung: Kettenabbruchmethode (Sangersequenzierung)

1. viele dsDNA denaturieren

2. ssDNA in 4 Gefäße verteilen mit jeweils einem ddNTP (z.B. ddGTP) & drei anderen dNTP´s (z.B. dCTP, dATP, dTTP)

3. Annealing: mit P32 (am 1. Phosphat) markierten, bekannten Primer dazugeben

4. DNA-Polymerase hinzugeben

→ Elongation: DNA-Pol. füllt so lang auf, bis irgendwann ein ddNTP eingebaut (in allen 4 Gefäßen unterschiedliches), dann bricht Elongation ab (Termination)

5. Denaturierung

6. Gelelektrophorese

→ Auftrennen der ssDNA nach Größe

7. Röntgenfilm auflegen

→ P32 markierte Primer werden sichtbar (aufgefüllte DNA & Templates nicht) & es kann Sequenz abgelesen werden (von unten nach oben)

heute mit Taq (hitzebeständige Polymerase) & floureszierenden ddNTP´s (alle andere Farbe) & alle in einem Gefäß

PCR (Polymerase-chain-reaction)

zum Amplifizieren einer definierten DNA-Sequenz (oft aus nur einem Molekül). Ist eine bestimmte DNA da?

1. dsDNA denaturieren (95°C)

2. Annealing (60°C): 2! Primer zugeben, die an beiden Einzelsträngen der Target-Sequence binden

4. Elongation (72°C): Taq-Polymerase füllt aus freien dNTP´s Doppelstrang von 5´ zu 3´ wieder auf, wobei die Matritze von 3´ zu 5´ gelesen wird

5. Termination: Taq fällt nach tausenden Basen ab

6. erneutes Denaturieren (Taq hitzebeständig)

→ zyklische Wiederholung (bei jedem Zyklus verdoppelt)

qPCR (quantitative PCR)

um die anfängliche Menge einer Zielsequenz zu bestimmen (z.B. Viruslast). Wie viel der DNA ist da?

wie normale PCR aber im Gefäß ZUSÄTZLICH SYBR-Green => Floureszenzfarbstoff, der bei Bindung an dsDNA leuchtet. Also wird nach jedem Zyklus vor dem erneuten Denaturieren die Floureszenz gemessen. Je früher Wert beginnt, exponentiell anzusteigen, umso mehr Zielprodukt in der Probe.

Der Cycle-treshhold ist der Zyklus, bei dem die Floureszenz erstmals einen Schwellenwert übersteigt.

Auszugehen ist NICHT von der selben Menge an Startmolekülen (alle würden Ct gleichzeitig erreichen) sondern von der selben Menge an Probe (z.B. immer ein ml Speichel).

Methoden DNA

PCR: Herausfinden, ob bekannte DNA-Sequenz vorhanden

qPCR: Herausfinden, wie viel von der bekannten DNA-Sequenz vorhanden

Southern-Blot: Nachweisen von DNA

cDNA Herstellung

Damit mit RNA gearbeitet werden kann, sonst zu instabil. Muss erst in cDNA überführt werden

1. RNA aufreinigen

2. Annealing mit Poly-T-Oligonukleotid (ist komplementär zum PolyA-Tail der RNA bei Eukaryoten, also schon bekannt)

3. Elongation: herstellen des Hybriddoppelstrangs (RNA/DNA) mittels Reverse Transkriptase & freien dNTP´s

4. Trennung des Doppelstrangs mit RNaseH

5. Herstellung einer dsDNA mit DNA-Polymerase

um nur mRNA zu erwischen & nicht zb rRNA: Poly-T-Oligonukleotid bindet nur an den PolyA-Tails der mRNA

RT-PCR (Reverse-Transkriptase PCR)

um Ziel-RNA zu amplifizieren, dient dem Nachweis von Genexpression. Wird ein bestimmtes Gen in Zelle/Gewebe transkribiert?

ABER PCR kann nur DNA amplifizieren, nicht RNA. Deswegen erst mRNA→cDNA.

1. mRNA aus Gewebe isolieren & aufreinigen

2. Annealing mit Poly-T-Oligonukleotid-Primern

3. Elongation mit Reverser Transkriptase

→ cDNA-Pool (Transkriptom des Gewebes)

4. PCR der cDNA mit spezifischen Primern (binden an Ziel-cDNA, falls sie in Probe vorhanden)

5. Gelelektrophorese (wenn Bande: Gen wird exprimiert, wenn keine: nicht)

RT-qPCR (RT-quantitative PCR)

exakte Expressionsstärke eines Gens bestimmen. Wie viel meines gesuchten Gens wird in Zelle/Gewebe transkribiert?

Theoretisch nach RT-PCR (sagt nur, OB Gen exprimiert wird. Wenn bei RT-PCR Bande, dann RT-qPCR machen) aber RT-qPCR ersetzt RT-PCR meist weil es qualitativ + quantitativ ist.

Auch mit SYBR-Green (flouresziert bei Bindung an dsDNA)

PCR´s:

1. PCR: DNA vorhanden?

z.B: Es soll überprüft werden, ob das BRCA1-Gen im Genom eines Patienten vorhanden ist.

2. qPCR. DNA Menge?

z.B: Die Kopienzahl eines viralen DNA-Genoms im Blut soll bestimmt werden.

3. RT-PCR: Gen (cDNA als Surrogat) exprimiert?

z.B: Es soll untersucht werden, ob das Gen GFAP in Astrozyten exprimiert wird.

4. RT-qPCR: Expressionsstärke (cDNA als Surrogat)?

z.B: Die Expression von BDNF soll im Hippocampus und im Cortex quantitativ verglichen werden.

Northern Blot

um RNA nachzuweisen + wie groß ist mein Transkript (kann man bei RT-PCR nicht herausfinden, da man immer nur mit BEKANNTER Zielsequenz arbeitet & die Sequenz des restlichen Transkriptes nicht bekannt ist)?

1. mRNA isolieren (aus Gewebe/Zellen)

2. Gelelektrophorese (mRNA der Größe nach aufteilen)

3. mit Formaldehyd behandeln (damit sich RNA nicht intern auffaltet)

4. auf Membran blotten (fixieren)

5. mit radioaktiver anti-sense RNA inkubieren (wenn sense-RNA in Probe vorhanden bindet sie, sonst nicht)

6. Rest abwaschen

7. Autoradiogramm mit Röntgenfilm → Schwärzung

Antisense RNA-Sonde Herstellung

bekanntes Stück bei RT-PCR schon durch die 2 flankierenden Primer amplifiziert, dieses könnte ich als Antisense-Sonde verwenden

1. RT-PCR mit Taq-Polymerase: fügt immer einen A-Overhang an

2. dadurch cDNA in Vektor-Plasmid wie beim Klonieren einbauen

Problem: kenne Orientierung des Stücks in MCS aufgrund der identischen Overhangs nicht. Entweder Sequenzieren (teuer), Restriktionsverdau oder PCR.

3. je nach Orientierung passende RNA-Polymerase (entweder für T7 oder SP6)

4. Plasmid linearisieren (aufschneiden) je nach Orientierung (wenn T7-RNA-Polymerase nach SP6 aufschneiden & umgekehrt)

5. NTP´s zugeben & auffüllen lassen

können auch mit Floureszenz… markiert sein

Restriktionsverdau mit Sal1

Herausfinden, wie cDNA für Antisense-Sonden Herstellung in Vektor orientiert.

Sal1 ist Restriktionsenzym & sitzt an definierter Stelle im Vektor zwischen 2 RNA-Polymerase Promotoren.

1. ein Sal1-Enzym verweden, um zu schneiden

→ Fragmente unterschiedlicher Länge, ja nach Orientierung des Inserts

2. Gelelektrophorese, um Fragmente sichtbar zu machen & mit erwarteten vergleichen

3. je nach Orientierung richtigen Promotor für Antisense-Sonde wählen

PCR zum Herausfinden der Insert-Orientierung bei Antisense-Sonden Herstellung

T7 & SP6 eigentlich Promotoren für RNA-Polymerase. Diese befinden sich auf beiden Seiten der MCS, in entgegengesetzte Richtung.

1. Primer-Sequenz für einen der Promotoren erstellen & einen Insert-Primer

2. PCR machen

3. je nach gewähltem Primer & Orientierung des Inserts entweder PCR-Produkt oder nicht

→ rückschließen auf Orientierung des Inserts

nach Northern Blot

kennt nach Northern Blot Größe der mRNA & nach RT-PCR kurze Sequenz der cDNA. Kann jetzt mit Sequenzen aus cDNA-Bibliothek vergleichen:

1. Sonde der bekannten cDNA erstellen (radioaktiv, floureszent markieren)

2. mögliche cDNA´s aus Bibliothek (zb. spezifisch für Gehirnzellen) kaufen & kultivieren

3. Lyse der Bakterien

4. Hybridisierung mit Sonde behandeln

→ Sonde bleibt an richtiger Kultur kleben

cDNA-Bibliothek

enthält das gesamte Transkriptom eines Gewebes (alle Gene, die exprimiert werden z.B. in Gehirn), in Form von vielen full-length cDNA´s

→ RNA oft gewebespezifisch (in Fibroblasten nicht gleiche Gene exprimiert wie in Neuronen)

genomische Bibliothek

enthält gesamtes Genom eines Organismus, aufgeteilt in viele Fragmente

→ DNA in allen Zellen eines Organismus gleich

mRNA in Zellen nachweisen

1. Embryo fixieren

2. Antisense-Sonde mit Label (zb DIG) versehen

3. über Nacht bei hoher Temperatur inkubieren → antisense-Sonde bindet stabil an Sense-RNA

4. Überschüssige Sonden abwaschen

5. mit Anti-DIG-Antikörper inkubieren → AK bindet stabil auf DIG (& dadurch auf Antisense-sonde)

6. Überschüssige AK abwaschen

7. mit Pigment behandeln, der mit Enzym auf AK reagiert & Färbung erzeugt

→ Färbung, wo in Zellen bestimmtes Gen exprimiert wurde (weil dort passende sense-mRNA für Antisense-Sonde)

Methoden RNA

RT-PCR: Herausfinden, ob Gen exprimiert wird

RT-qPCR: Herausfinden, wie stark Gen exprimiert wird

Northern Blot: Nachweis von RNA & herausfinden, welche Größe das Transkript hat

RACE (rapid amplification of cDNA ends)

um cDNA eines Gens zu vervollständigen, wenn 3´-(wo Poly-A) oder 5´-(wo Cap) Ende nicht bekannt.

3´-RACE: 3´-Ende unbekannt, Mittelstück bekannt, mRNA Vorlage

1. hängt an mRNA einen PolyT-Primer (bindet an PolyA-Schwanz)

2. Reverse Transkriptase füllt bestenfalls wieder bis bekanntes Stück auf

3. PCR mit bekanntem Primer von cDNA (Mitte) & PolyT-Primer (erkennt PolyA-Struktur) am 3´

→ cDNA-Stück, welches 3´-Ende der mRNA enthält

5´-RACE: 5´-Ende unbekannt (schwieriger, weil keine eindeutige Struktur wie PolyA an 3´), Mittelstück bekannt, mRNA Vorlage

1. Primer (der wegen cDNA bekannt) für Mittelstück an mRNA hängen

2. von DNA-Polymerase nach vorne auffüllen lassen

3. Polymerase hängt vorne künstlich einen PolyC-Tail an (ist wieder bekannt)

4. PCR mit bekanntem Primer der cDNA (Mitte) & PolyG-Primer (erkennt PolyC-Tail) am 5´

→ cDNA-Stück, welches 5´-Ende der mRNA enthält