Chapitre 9 - PCR

Ces flashcards couvrent les concepts clés associés à la PCR, comme son histoire, sa méthodologie et les défis liés à la contamination.

Qu'est-ce que la PCR ?

La PCR, ou réaction de polymérisation en chaîne, est une technique utilisée pour amplifier une séquence spécifique d'ADN.

Qui a développé la PCR ?

La PCR a été développée par Kary Mullis en 1983.

Quel prix a été décerné pour la découverte de la PCR ?

La découverte de la PCR a été couronnée par le prix Nobel de chimie en 1993.

Quels sont les réactifs nécessaires pour la PCR ?

Les réactifs nécessaires incluent l'ADN matrice, deux amorces (primers), des dNTPs, un tampon PCR, du Mg2+ et de l'ADN polymérase thermostable.

À quelle température la dénaturation de l'ADN se produit-elle ?

La dénaturation de l'ADN se produit à une température de 94-96 °C.

Quelle est la température d'extension lors de la PCR ?

La température d'extension est de 72 °C.

Quel est l'effet de la température d'annealing dans la PCR ?

La température d'annealing est de 50 à 60 °C, permettant l'hybridation des amorces.

Comment évolue le nombre de copies d'ADN au cours des cycles de PCR ?

Le nombre de copies d'ADN augmente exponentiellement avec chaque cycle, souvent décrite par la formule x = x0 ⋅ 2n.

Quels types d'ADN coexistent lors de l'amplification ?

Il existe trois espèces d'ADN : les brins initiaux, des brins longs limités par une amorce, et des fragments d'ADN de la taille voulue.

Quels facteurs peuvent limiter l'efficacité de la PCR ?

Les facteurs limitants incluent la consommation de substrats, la stabilité des réactifs et l'inhibition par des produits finaux.

Quelle est la température optimale pour l'activité de l'ADN polymérase Taq ?

La température optimale (Topt) pour l'ADN polymérase Taq est de 72 °C.

Qu’est-ce que le mastermix dans la PCR ?

Le mastermix est un mélange qui assure une qualité uniforme pour tous les réactifs utilisés dans la PCR.

Pourquoi la concentration d'ADN doit-elle être maintenue en dessous de 10 ng/µl ?

Pour éviter un signal trop faible ou des problèmes de contamination lors de la PCR.

Quelles sont des méthodes d'analyse des produits d'amplification ?

Les méthodes incluent l'électrophorèse sur gel d'agarose, l'électrophorèse capillaire et le séquençage.

Quels types de contamination peuvent affecter la PCR ?

Les types de contamination incluent la contamination croisée, l'ADN des expérimentateurs et des réactifs contaminés.

Quelles contre-mesures peuvent être prises pour éviter la contamination lors de la PCR ?

Des contre-mesures incluent la séparation des zones de travail, l'utilisation de gants et la décontamination des surfaces.

Quel est le rôle spécifique des amorces (primers) dans la PCR ?

Les amorces définissent les limites de la séquence d'ADN à amplifier et fournissent une extrémité 3'-OH libre pour l'ADN polymérase.

Que signifie l'acronyme dNTPs ?

Les dNTPs (désoxyribonucléosides triphosphates) sont les quatre types de nucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) servant de blocs de construction pour le nouvel ADN.

Pourquoi le magnésium (Mg^{2+}) est-il essentiel dans le mélange PCR ?

Le Mg^{2+} est un cofacteur indispensable à l'activité catalytique de l'ADN polymérase.

Combien de cycles sont généralement effectués lors d'une PCR standard ?

Une PCR standard comprend généralement entre 25 et 35 cycles d'amplification.

Qu'est-ce que l'étape de 'pré-dénaturation' ?

C'est une étape initiale de 2 à 10 minutes à 95^{\circ} C pour s'assurer que l'ADN matrice est complètement dénaturé avant le début des cycles.

Quelle est la caractéristique principale de l'ADN polymérase Taq ?

Elle est thermostable, ce qui signifie qu'elle reste fonctionnelle même après avoir été exposée aux hautes températures de dénaturation (95^{\circ} C).

Pourquoi la PCR est-elle considérée comme une méthode de diagnostic sensible ?

Parce qu'elle permet de détecter et d'amplifier une seule molécule d'ADN cible parmi des millions d'autres molécules.

Qu'est-ce que la phase de plateau dans la courbe d'amplification ?

C'est le moment où le rendement de la réaction diminue et finit par s'arrêter à cause de l'épuisement des réactifs (dNTPs ou amorces) ou de la dégradation de la polymérase.

Comment s'appelle l'étape où les deux brins d'ADN se séparent ?

Cette étape s'appelle la dénaturation, elle se produit généralement entre 94 et 96^{\circ} C.

Quelle est la formule mathématique modélisant l'amplification théorique de l'ADN ?

Le nombre de copies est modélisé par la formule x = x_0 \cdot 2^n, où n est le nombre de cycles.

Qu'est-ce que l'étape d'hybridation des amorces ?

C'est l'étape (annealing) où la température est abaissée entre 50 et 60^{\circ} C pour permettre aux amorces de se fixer aux séquences complémentaires de l'ADN matrice.

Pourquoi la Taq polymérase est-elle préférée aux polymérases classiques ?

Parce qu'elle est thermostable, ce qui lui permet de ne pas être détruite lors de la phase de dénaturation à 95^{\circ} C.

Quel est le risque de mettre trop d'ADN matrice dans le mélange réactionnel ?

Une concentration d'ADN supérieure à 10 ng/\mu l peut entraîner une inhibition de la réaction ou des problèmes de contamination.

Quel est le rôle du tampon de réaction (PCR buffer) ?

Il maintient un pH stable et fournit l'environnement chimique (force ionique) optimal pour l'activité de l'ADN polymérase.

Pourquoi réalise-t-on une extension finale après les cycles de PCR ?

Une phase finale à 72^{\circ} C d'environ 5 à 10 minutes permet de s'assurer que tous les brins synthétisés sont complets.

Qu'est-ce qu'une contamination croisée en PCR ?

C'est le transfert accidentel d'ADN d'un échantillon positif vers un échantillon négatif lors de la manipulation.