Genética - Perguntas de desenvolvimento

Qual o objetivo do Teste de Ames?

O objetivo do teste de Ames é avaliar o poder mutagénico de compostos potencialmente carcinogénicos por deteção de revertentes (passagem de mutante ao estado selvagem). Muitos carcinogénicos só são mutagénicos depois de terem sido metabolizados a nível hepático.

Como se processa este teste para ter validade com bactérias auxotróficas?

No teste com bactérias, utilizamos uma estripe de Salmonella auxotrófica para a histidina (his-), de modo a ser mais suscetível a mutações, com sistema de reparação por excisão inativo e sem a presença de camada lipopolissacarídea.

 

São realizadas duas culturas: uma de controlo, onde se colca a amostra num meio de agar com nutrientes e uma cultura experimental, onde a amostra está num meio com nutrientes e com o mutagénico em análise.

 

As culturas vão ser transferidas para uma placa de Petri sem histidina, onde as bactérias auxotróficas não conseguem crescer. Se, após uma incubação de 12 h, na placa que contém as bactérias e o agente mutagénico houver crescimento, concluímos que as bactérias já não necessitam de histidina para crescer, passando de mutantes ao estado selvagem.

Como se processa este teste para ter validade com enzimas de ratinho?

No teste com enzimas de ratinho, estimula-se inicialmente o ratinho com Arochior. Depois são feitos 2 tubos de teste, em que se inserem a estripe de Salmonella, as enzimas hepáticas do ratinhos no tubo controlo e no tubo experimental adiciona-se também o mutagénico em estudo.

 

Ambos os tubos vão ser plaqueados numa placa de Petri sem histidina e, após uma incubação de 12 h, se ocorrer crescimento na placa contendo o conteúdo do tubo experimental, concluímos que estamos na presença de revertentes e que o mutagénico em estudo é, provavelmente, carcinogénico.

Quais os valores que podem ser obtidos no índice de mutagenicidade e o seu significado?

Posteriormente calcula-se o índice de mutagenicidade, que é a razão entre os revertentes induzidos e os revertentes espontâneos.

 

Se o resultado for:

entre 0,6 e 0,7 é indicativo de toxicidade;

igual a 1, não houve indicação de revertentes;

maior do que 1, não houve revertentes;

maior ou igual a 2, substância considerada mutagénica

 

O método de terminação da cadeia por didesoxinucleótidos ou de Sanger é usado para sequenciar o DNA. Diga o fundamento e como se processa este método para se determinar a ordem dos nucleótidos num gene.

O método de Sanger ou método de terminação de cadeia por didesoxinucleótidos consiste ma adição de nucleotídeos modificados (sem -OH no carbono 3), os didesoxinucleótidos (ddNTPs) através da DNA polimerase, impedindo o crescimento de um fragmento de DNA em replicação, o que permite obter fragmentos de do mesmo DNA com tamanhos diferentes.

Para este método é necessário a cadeia molde, DNA polimerase, cadeia primer, desoxinucleótidos (dNTPs, sem -OH no carbono 2) e que permitem aumentar cadeia de DNA) e didesoxinucleótidos (terminadores de cadeira) que são marcados com fluorocromos.

Os desoxinucleótidos vão ser incorporados na cadeia molde, com o auxílio da DNA polimerase até à adição de um didesoxinucleótido que termina obrigatoriamente a síntese, originando fragmentos de DNA com vários tamanhos.

Posteriormente, os produtos são desnaturados e separados num gel de sequenciação de poliacrilamida por capilaridade (eletroforese). Depois de serem separados os didesoxinucleótidos (ddG, ddA, ddC e ddT) é utilizado um detetor de fluorescência e a separação é realizada através das diferentes cores através de uma sequenciação automática por computador.

O fago lambda quando infeta células de E.coli num meio rico em glucose,
estabelece o ciclo lítico. Diga, justificando, porque é que se verifica e como é feita a ativação sequencial dos diferentes genes que conduzem ao estabelecimento do ciclo lítico.

O fago infeta a bactéria, introduzindo o seu material genético no genoma da mesma e faz a sua própria replicação, de seguida ocorre lise celular e libertam-se partículas virias.

 

O ciclo lítico ocorre quando o meio é rico em nutrientes, ou seja, em glucose, uma vez que ocorre a inibição da AMPc (cuja quantidade é inversamente proporcional à da glucose), aumentando os níveis de HFI que degrada o cII (ao diminuir a concentração de cIII produzida por N) e não pode ativar o repressor cI nem a integrase. Isto permite que o cro se ligue ao O_R3 no operador, impedindo que a RNA polimerase expresse os genes da lisogenia, ativando o gene Q e os genes tardios do ciclo lítico.

O fago lambda infecta células de E.coli num meio isento de glucose, estabelece o ciclo lisogénico. Diga, justificando, porque é que isto se verifica e como é feita a ativação sequencial dos genes que conduzem ao estabelecimento do ciclo lisogénico.

O fago infeta a bactéria, introduzindo o seu material genético no genomas da mesma e incorpora-se no cromossoma da bactéria. Como tal, só se replica quando ocorrer replicação da própria bactéria, trata-se de um pró-fago. Os primeiros genes a serem expresso são N e cro.

 

Quando o meio é pobre em nutriente, ou seja, pobre em glucose, a AMPc aumenta (quantidade é indiretamente proporcional à de glucose), o que vai inibir a HfI (enzimas hospedeiras e mecanismo de defesa do hospedeiro) e o gene N (anti-terminador) faz a expressão de cIII. cIII vai proteger o cII e o AMPc vai estabilizá-lo, logo o cII que vai ativar cI (repressor lambda). cI vai ligar-se a O_R1 e O_R2 na forma dimérica, originando integrasse e impedindo a expressão de cro pela RNA polimerase. O cI não ativa genes exceto ele próprio e a integração estabelece a lisogenia.

Diga o que entende por PCR, qual o fundamento e como se processa o método.

O PCR (polymerase chain reaction) é uma técnica que permite fazer a ampliação de sequências conhecidas de DNA. Para tal, é necessário 2 primers (iniciadores), pequenas quantidades de DNA, magnésio, desoxinucleótidos, Taq DNA polimerase, banho programável (desnaturação a 94ºC por 5 minutos, ligação dos primers a 30ºC-60ºC durante 30 segundos, síntese de DNA a 72ºC durante 3 a 4 minutos e ciclos repetidos até 60x) e controlos negativo e positivo.

O controlo negativo, sem DNA, verifica os reagentes quanto à contaminação e o positivo verificam se os reagentes e os primers funcionam e para mostrar a ausência da expressão de um gene (especialmente importante).

O DNA de interesse é isolado, desnatura a 94 ºC por 5 minuots, os primers ligam-se nas duas cadeias a 30 a 65ºC durante 30 segundos. A partir dos primers a Taq DNA polimerase sintetiza DNA a partir da cadeia molde a 72ºC .

Após isso, o DNA é desnaturado a 94ºC e hibridizam-se os primers a 60ºC, nas cadeia novas e antigas. Após 20 ciclos de amplificação, surgem cerca de 1 x 10⁶ cópias da sequência de DNA.

Diga o que entende por RT-PCR, qual o fundamento e como se processa o método.

O RT-PCR (rverse transcriptase PCR) é mais rápido e sensível.

 

Inicialmente no mRNA de interesse dá-se a hibridização do primer oligo (dT), depois é adicionada a transcriptase reversa (com dNTPs) que converte o mRNA em cDNA.

 

Isto ocorre porque o mRNA é degradado pela RNase H, o fragmento é usado como primer para a síntese de DNA com o auxílio da DNA polimerase I que remove os primers e sintetiza a cadeia e, posteriormente, os fragmentos de DNA são ligados pela DNA ligase eforma-se o cDNA.

 

O cDNA amplificado por PCR permite identificar o RNA de interesse.

Diga o que entende por qPCR, qual o fundamento e como se processa o método.

O qPCR permite quantificar com alta precisão o cDNA presenta numa amostra desconhecida.

 

A transcriptase reversa é usada na primeira etapa e a amplificação do DNA é feita na presença de SYBR green (corante fluorescente) que cora dsDNA. A amostra é colocada num detetor de laser no termociclador que deteta a fluorescência verde SYBR e quantifica o produto. As deteções são normalizadas para um gene de referência.

 

Inicialmente a síntese é exponencial, porque a quantidade do produto do PCR é pequena e os reagentes não são limitantes, na segunda fase a síntese é linear, dado que os produtos continuam a acumular-se, mas a eficácia de ração cai à medida que os reagentes se tornam limitantes, na terceira fase a acumulação de produtor atinge um platô à medida que um ou mais reagentes são gastos.

 

O qPCR ocorre ao longo de vários ciclos (20 a 40).

Complete a tabela

O que é que os dímeros de timina originam?

Transições e Transversões

Quais as causas que originam os dímeros de timina?

Luz UV

Quais as formas de reparação procariota para os dímeros de timina?

Fotorreativação, PRE, Excisão geral

Quais as formas de reparação eucariota para os dímeros de timina?

Excisão, Pós-replicação, Translesão, NER

Quais as consequências dos dímeros de timina?

Xerodermia pigmentosa, Cancro da pele

O que é que a quebra de duas cadeias origina?

Quebra do DNA

Quais as causas que originam a quebra de duas cadeias?

Fatores endógenos ou exógenos (reações catalisadas pelo sistema
P450, metabolismo anaeróbio, poluentes, metais pesados)

Quais as formas de reparação procariota para a quebra de duas cadeias?

Ligase D, HR, NHEJ

Quais as formas de reparação eucariota para a quebra de duas cadeias?

Ligase 4, HR, NHEJ

Quais as consequências da quebra de duas cadeias?

Morte celular, Carcinogénese

O que é que a alquilação origina?

Transições

Quais as causas que originam a alquilação?

Agentes alquilantes (EMS)

Quais as formas de reparação procariota para a alquilação?

O-6metilguanina DNA metiltransferase

Quais as formas de reparação eucariota para a alquilação?

BER

Quais as consequências da alquilação?

Apoptose

O que é que a lesão oxidativa origina?

Transversões, Transições e Bloqueio de replicação

Quais as causas que originam a lesão oxidativa?

Espécies reativas de oxigénio

Quais as formas de reparação procariota para a lesão oxidativa?

Sistema SOS

Quais as formas de reparação eucariota para a lesão oxidativa?

BER

Quais as consequências da lesão oxidativa?

Promoção e ativação da apoptose, inibição da progressão do ciclo celular

O que é que os locais de depurinação originam?

Transições, Transversões, Perda de bases

Quais as causas que originam os locais de depurinação?

PAH e metabolitos endógenos

Quais as formas de reparação procariota para os locais depurinação?

BER

Quais as formas de reparação eucariota para os locais depurinação?

BER

Quais as consequências dos locais depurinação?

Cancro do pulmão e do fígado

O que é que a 8-OxoG origina?

Transversões

Quais as causas que originam a 8-OxoG ?

Lesão oxidativa, ROS

Quais as formas de reparação procariota para a 8-OxoG?

Sistema GO

Quais as formas de reparação eucariota para a 8-OxoG?

Sistema GO e BER

Quais as consequências da 8-oxoG?

Inibição da progressão do ciclo celular