Bioteknisten järjestelmien perusteet

Tekninen järjestelmä

Komponenttien yhdistelmä, joka on suunniteltu suorittamaan tietty toiminto

Biotekniset järjestelmät

Biologisia komponentteja hyödyntävät tekniset järjestelmät. Merkityksellisimpiä molekyylien havainnointiin kykenevät biosensorit ja bioaffiniteettimääritys-järjestelmät

Mihin molekyylien havainnointiin kykenevien bioteknisten järjestelmien toiminta perustuu

Niiden toiminta perustuu biomolekyylien reaktioihin

• Biomolekyyli sitoutuu toiseen molekyyliin: Proteiinit (erityisesti vasta-aineet) ja nukleiinihapot

• Biomolekyyli katalysoi kemiallista reaktiota: Entsyymit (+ ribotsyymit & deoksiribotsyymit)

Vasta-aineiden luonnollinen rooli

• Neutraloidaan vieras vaarattomaksi

• Merkataan tuhottavaksi (opsonisaatio)

• Aktivoidaan komplementti-järjestelmä tuhoamaan bakteerin soluseinä

Vasta-aineen rakenne

• Koostuu neljästä polypeptidistä:

  • 2 identtistä lyhyttä “kevyttä ketjua”

    • Kevyissä ketjuissa 2 domeenia:

      • VL - variable light chain domain (vasta-aineiden välillä viahteleva sekvenssi)

      • CL - constant light chain domain (vasta-aineiden välillä hyvin samankaltainen sekvenssi)

  • 2 identtistä pitkää “raskasta ketjua”

    • Raskaissa ketjuissa 4 domeenia:

      • VH - variable heavy chain domain (vasta-aineiden välillä vaihteleva sekvenssi)

      • CH1, CH2, CH3 - constant heavy chain domain 1, 2 & 3 (vasta-aineiden välillä hyvin samankaltainen sekvenssi)

• Polypeptidiketjut kiinnittyneet toisiinsa disulfidi-sidoksin

• Yhdistelmä osat

  • Fv - variable fragment: koostuu VL ja VH domeeneista (saksien sisäpuolella)

  • Fab - antigen-binding fragment: koostuu VL, CL, VH ja CH1 domeeneista (saksien ulkopuolella)

    • Fv:n ja Fab:n välillä joustava liitinosa, jolla voidaan sitoutua esim. bakteerin pinnalla eri etäisyyksillä sijaitseviin kohdemolekyyleihin

  • Fc - crystallizable fragment, “constant fragment”: koostuu CH2 ja CH3 domeeneista (Ravun vartalo) ja glykolysoitunut (kovalenttisesti kiinni hiilihydraattiosa) 

Paratooppi

Vasta-aineen osa, joka tunnistaa antigeenin ja sitoutuu siihen. Eli kohdemolekyyliin sitoutuvat kohdat, jotka sijaitsevat Y:n käsien päissä Fv:n ja Fab:n alueella. Tämä on vaihtuva osa vrt. poran vaihtuviin päihin

Mitkä ovat paratoopin eli antigeeniin sitoutuvan osan muodostavat “vastaavuuden määrittävät lenkit” eli CDR-osat

• 3 kevyessä ketjussa (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)

• 3 raskaassa ketjussa (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)

• Näiden osien sekvenssi vaihtelee huomattavasti vasta-aineiden välillä

Negatiivinen valinta

Vain vahvimmin antigeeniin sitoutuvia vasta-aineita tuottavat B-solut säilyvät ja heikot tuhoutuvat 

Affiniteetti kypsyminen

Prosessi, jossa vasta-aineet käyvät läpi toistuvia mutaaatioita ja selektiota niiden affiniteetin tehostamiseksi tiettyjä antigeenejä kohtaa → Elimistön vasta-aineiden sitoutumisvoimakkuuden vahvistuminen

Vasta-aineluokat (Immunoglobuliinien pääluokat)

• lgG: yleisin, tärkeä sekundaarivasteessa

• lgM: ensimmäinen vaste, joka toimii pääosin verenkierrossa

• lgA: limakalvojen ja eritteiden vasta-aine

• lgE: allergiset reaktiot ja loiset

• lgD: B-solun pinnalla, tehtävää ei vielä tunneta

Milloin vasta-aineen luokka vaihtuu?

Silloin, kun raskaan ketjun C-domeenien geenisegmentti korvautuu toisella. Isotyypin vaihtuminen aiheutuu muutoksesta silmukoitumisessa tai geneettisellä rekombinaatiolla

Mitä tapahtuu lgM → lgG luokkamuutoksen yhteydessä

Verenkiertoon vapautuvien vasta-aineiden antigeeniin sitoutumisvoimakkuus kasvaa lgM → lgG luokkamuutoksen yhteydessä ja kun nisäkäs kohtaa saman antigeenin uudestaan 

• Immuunivasteen paraneminen tehosterokotteiden kanssa

Minkä luokan vasta-aineita käytetään bioteknisten järjestelmien “toiminnallisena osana”

“Toiminnallisena osana” käytetään usein lgG-luokan vasta-aineita

Polyklonaalinen vasta-aine

Liuos, joka sisältää seoksen erilaisia saman antigeenin eri epitooppeihin erilaisilla voimakkuuksilla sitoutuvia vasta-aineita

Polyklonaalisen vasta-aineen tuottaminen

• Voidaan tuottaa altistamalla nisäkäs antigeenille (immunisoimalla) - yleensä kani, lammas, vuohi

• Antigeenin tunnistavat B-solut aktivoituvat eläimessä

• Eläin alkaa tuottaa vasta-aineita antigeeniä vastaan → veren seerumissa antigeenin eri epitooppeihin sitoutuvia vasta-aineita

• Vasta-aineita sisältävää seerumia (“antiserum”) kerätään, kun veressä on paljon vasta-aineita ja kaikki vasta-aineet puhdistetaan liuokseen

• Immuunivaste voi vaihdella paljon eläinten välillä sekä saman eläimen eri tehosteannosten jälkeen

Monoklonaalinen vasta-aine ja miten sitä tuotetaan?

Liuos, joka sisältää vain yhteen epitooppiin sitoutuvia identtisiä vasta-aineita. Tuotetaan hybridooma-menetelmällä

Miten on mahdollista, että vasta-aineet voivat sitoutua niin moneen eri kohdemolekyyliin?

Vasta-aineiden rakenteellinen vaihtelu mahdollistaa lukuisten erilaisia kohdemolekyylejä tunnistavien vasta-aineiden synnyn, mutta jokainen vasta-aine on kuitenkin hyvin spesifinen oman kohde-epitooppinsa suhteen

Hybridoomasolu

Hybridi solulinja, joka on saatu aikaan fuusioimalla antigeenejä tuottava B-solu myeloomasolun kanssa

Adjuvantti

Immuunipuolustuksen aktivoitumista tehostava aine

Minkä luokan vasta-aineita ovat monoklonaaliset vasta-aineet

Monoklonaaliset vasta-aineet ovat lgG-luokan vasta-aineita

Hybridoomamenetelmän vaiheet

• Immunisaatio: Hiiri immunisoidaan halutulla antigeenilla monoklonaalisten vasta-aineiden tuotannon käynnistämiseksi

• Speelisolujen keräys: Immunisoidun eläimen perna poistetaan ja B-lymfosyytit eristetään

• Solufuusio: Pernan B-solut yhdistetään myeloomasolulinjan kanssa kemiallisesti (esim. PEG:llä) tai sähkösynteesillä, jolloin syntyy hybridoomasoluja

• Selektio: Soluseos kasvatetaan selektiivisessä HAT-mediumissa, joka mahdollistaa vain fuusioituneiden solujen eloonjäämisen

• Seulonta: Hybridomasolut testataan (esim. ELISA-menetelmällä) sen havaitsemiseksi, tuottaako kukin klooni haluttua spesifistä vasta-ainetta

• Viljely ja säilytys: Halutut hybridoomasolut kasvatetaan ja säilytetään, esim. nestetyyppi-inejktointia varten jatkokäyttöön

HAT-mediumi

Kasvatusliuos, joka sisältää Hypoksantiinia, Aminopteriinia ja Tymidiiniä. Estää sellaisten solujen kasvun, joissa ei toimivaa HGPRT-entsyymiä

Epitooppi

Alue, johon vasta-aineen paratooppi sitoutuu antigeenin pinnalla. Voi olla jatkuva (“continuous”) tai epäjatkuva (“discontinuous”)

• Jatkuva epitooppi: Sitoutumisessa mukana olevat aminohapot ovat peräkkäin proteiinin peptidiketjussa

• Epäjatkuva epitooppi: Sitoutumisessa mukana aminohappoja peptidiketjun/-ketjujen eri kohdissa

Epitoopit ja sitoutuminen

• Epäjatkuvat epitoopit ovat konformationaalisia epitooppeja, eli antigeeniproteiinin pitää olla laskostunut oikein (oikea 3D-rakenne), jotta vasta-aine pystyy tunnistamaan epitoopin 

• Myös jatkuva epitooppi voi olla konformationaalinen, mutta ei välttämättä ole (vasta-aine voi tunnistaa lineaarisen epitoopin myös denaturoidusta proteiinista tai lyheystä peptidistä)

Hapteeni

Pieni antigeeni, johon ei mahdu sitoutumaan kahta vasta-ainetta samanaikaisesti

Päällekkäiset epitoopit

Eri antigeenin osat, jotka voivat olla fysikaalisesti lähekkäin tai osittain samalla alueella, voivat sitoutua samaan vasta-aineeseen tai eri vasta-aineisiin. Mahdollistaa sen, että yhdellä vasta-aineella voi olla kyky tunnistaa useampi kuin yksi kohdemolekyyli tai useita kohdepisteitä samalla antigeenillä, mikä lisää immunologisen vastaan monipuolisuutta

Vasta-aineen sitoutuminen

Sitoutuminen tapahtuu heikkojen vuorovaikutusten avulla, kun paratoopin ja epitoopin kolmiulotteiset pinnanmuodot sopivat yhteen ja vastakkaisilla pinnoilla toisiaan puoleensa vetävät ominaisuudet. Kun heikkoja vuorovaikutuksia on useita, niiden yhteisvaikutuksesta kahden molekyylin sitoutuminen on voimakasta

• Heikot vuorovaikutusket: Vetysidokset, ionisidokset, Van der Waals -vuorovaikutukset ja hydrofobiset vuorovaikutukset

Mitkä asiat vaikuttavat vasta-aineen affiniteettiin?

Sitoutumisen voimakkuuden määrittää kuinka voimakas on sitoutumisessa mukana olevien heikkojen vuorovaikutusten yhteisvaikutus. Tähän vaikuttaa myös pintojen kolmiulotteisten rakenteiden yhteensopivuus. Lisäksi myös ulkoiset olosuhteen, kuten pH, lämpötila ja ionivahvuus voivat vaikuttaa heikkoihin sidoksiin. Polyklonaalisessa vata-aineessa eri vasta-aineilla on eri affiniteetit (ei voida määrittää tarkkaa affiniteettia)

Mitä affiniteettivakio kertoo?

Affiniteettivakio KA kertoo tasapainovakion reversiibelille sitoutumisreaktiolle. Mitä suurempi, se on niin sitä vahvempi on sitoutuminen

Mikä nopeuttaa reaktiota?

Lämpötilan nostaminen ja ravistelu nopeuttavat reaktiota. Mutta liian korkea lämpötila saa aikaan denaturaatiota

Affiniteetti

Voimakkuus, jolla vasta-aineen 1 paratooppi sitoutuu epitooppiin

Luokkien paratoopit

• Vasta-aineissa on useampi paratooppeja (multivalentteja)

  • lgG - 2 paratooppia; divalenttinen

  • lgM - 10 paratooppi; dekavalenttinen

• Jos vasta-aine pystyy sitoutumaan kohteeseen useammalla kuin yhdellä paratoopilla samanaikaisesti, sitoutumisvoimakkuus on korkeampi kuin voisi olettaa paratoopin affiniteetin perusteella (esim. lgG:lle sitoutumisvoimakkuus on > 2x paratoopin affiniteetti

Aviditeetti

Usean samanaikaisen sitoutumisen tuloksena aiheutuvaa suurempaa kokonaissitoutumisvoimakkuutta (Merihätä-köysi esimerkki)

Ristireagointi

Jos toisessa molekyylissä on hyvin samankaltainen pintarakenne kuin kohde-epitoopissa, vasta-aine voi sitoutua myös tähän molekyyliin

Mitä vasta-aineen spesifisyys kertoo?

Se kertoo, kuinka hyvin vasta-aine erottaa kaksi rakenteellisesti hyvin lähellä toisiaan olevaa antigeeniä = kuinka suuri ero on vasta-aineen affiniteettivakioissa näille antigeeneille → Vasta-aineen hyvä spesifisyys tarkoittaa, että se sitoutuu vain yhdenlaiseen molekyyliin (ei ristireaktiota muita molekyylejä kohtaan)

Immunomääritykset

Testit, jotka käyttävät vasta-aineita mittaamaan analyytin pitoisuutta näytteessä. Käytetään vasta-aineen ja antigeenin välistä biospesifistä tunnsitusreaktiota tuottamaan mittattava signaali niin, että signaali riippuu antigeenin pitoisuudesta näytteessä 

Antigeeni

Molekyyli, jolle voidaan tuottaa vasta-aineita → Jokaisella vasta-aienella on antigeeni (= molekyyli, johon vasta-aine sitoutuu)

Analyytti

Molekyyli, jonka pitoisuutta mitataan analyysissä

Kilpaileva immunomääritys

Yleinen periaate: Analyytti ja leimattu analyyttianalogi kilpailevat sitoutumisesta vasta-aineeseen. Kilpailevassa immunomäärityksessä vain yksi vasta-aine sitoutuu analyyttiin 

Kilpailevan immunomäärityksen vaiheet

• Alkutilanne: Kiintokantajan pintaan kiinnitettynä vasta-aine, joka pystyy sitoutumaan analyyttiin → Vasta-ainetta kiinni pinnassa rajoitettu määrä

• Määritys alkaa: Lisätään analyytti (tuntemanton määrä näytteessä) ja leimattu analyyttianalogi (tunnettu määrä puskurissa). Inkuboidaan määritystä (reaktion annetaan tapahtua). Analyytti ja leimattu analyyttianalogi kilpailevat sitoutumsiesta vasta-aineisiin (rajoitettujen sitoutumispaikkojen takia osa jää liuokseen)

• Pesut: Sitoutumattomat analyytti- ja analyyttianalogi-molekyylit pestään pois 

• Mittaus: Mitataan leiman signaali, joka on suoraan verrannollinen läsnä olevan leiman määrään. Mitataan sitoutumiskohtia, joissa ei analyyttiä kiini

  • Mitä pienempi signaali, sitä suurempi analyytti pitoisuus näytteessä

Mitä kilpailevia immunomäärityksiä on?

• “Competitive immunoassay” (kompetitiivinen immunomääritys)

• “Reagent limited immunoassay” (rajoitetun reagenssin immunomääritys)

• Nimitys leimateknologian mukaan:

  • Radioimmunoassay (RIA)

  • Enzyme immunoassay (EIA)

  • Fluoroimmunoassay (FIA) 

Ei-kilpaileva immunomääritys

Yleinen periaate: Analyytti sidotaan pintaan kiinnitetyn ja leimatun vasta-aineen väliin. Helpompi tehdä herkempiä määrityksiä → Pienemmät pitoisuuserot näkyvät selkeämmin, kuin kilpailevassa

Ei-kilpailevan immunomäärityksen vaiheet

• Alkutilanne: Kiintokantajan pintaan kiinnitettynä vasta-aine, joka pystyy sitoutumaan analyyttiin (Yleensä monoklonaalinen vasta-aine). Vasta-ainetta kiinni pinnassa ylimäärä suhteessa mitattaviin analyyttimääriin 

• Määritys alkaa: Lisätään analyytti (tuntematon määrä näytteessä). Inkuboidaan - annetaan analyytin sitoutua sitojavasta-aineeseen

• Leima-vasta-aineen lisäys: Pesujen jälkeen lisätään leimattu vasta-aine. Inkuboidaan - annetaan leimavasta-aineen sitoutua analyyttiin

• Pesut: Sitoutumattomat leimavasta-aineet pestään pois

• Mittaus: Mitataan leiman signaali. Signaalin suuruus suoraan verrannollinen läsnä olevan leiman määrään. Mitataan sitoutumiskohtia, joissa analyytti kiinni

  • Mitä suurempi singaali, sitä suurempi analyyttipitoisuus näytteessä 

Miten kilpaileva ja ei-kilpaileva immunomääritykset eroavat?

• Kilpaileva immunomääritys: Signaali laskee, kun analyytin pitoisuus kasvaa

  • Paljon analyyttiä - matala signaali

  • Vähän analyyttiä - korkea signaali

• Ei-kilpaileva immunomääritys: Signaali nousee, kun analyytin pitoisuus kasvaa

  • Paljon analyyttiä - korkea signaali

  • Vähän analyyttiä - matala signaali 

• Ei-kilpailevassa voidaan laittaa vasta-ainetta enemmän → Parempi tulos jos ylimäärin suhteessa analyyttiin 

Ei-kilpailevia immunomäärityksiä

• “Non-competitive immunoassay” (kilpailematon immunomääritys)

• “Sandwich immunoassay” 

• “Two-site immunoassay” (kaksipuolinen immunomääritys)

• “Reagent excess immunoassay” (reagenssi-ylimäärä-immunomääritys) → Taloudellisesti huono, jos lisätään turhan paljon ylimääräistä

• “Immunometric assay” (immunometrinen määritys)

• Nimitys leimateknologian mukaan:

  • Immunoradiometric assay (IRMA)

  • Immunofluorometric assay (IFMA)

Mistä hook-efekti johtuu ja mitä se tarkoittaa

Korkea analyyttipitoisuus antaa liian matalan tuloksen. Johtuu tilanteesta, jossa ei-kilpailevassa immunomäärityksessä on erittäin suuri pitoisuus antigeeniä tai vasta-ainetta. Tällöin liian suuri määrä antigeeniä tai vasta-ainetta estää oikean immuunikompleksin muodostumisen, koska kaikki sitovat osat ovat jo varattuja eikä “sandwich” -komplekisa pääse syntymään.

Ei-kilpaileva immunomääritys yksivaiheisena

• Analyytti ja leimavasta-aine lisätään samaan aikaan

• Riskinä Hook-efekti korkeilla analyyttipitoisuuksilla (signaali pieni vaikka analyyttipitoisuus suuri)

Heterofiiliset vasta-aineet

Joissain ihmisissä esiintyvät yleisesti vasta-aineisiin sitoutuvat vasta-aineet. Voivat häiritä merkittävästi immunomäärityksen toimintaa, joko saamalla aikaan singaalin vaikka analyytiä ei ole tai sitten estämällä analyytin sitoutumisen. Esim. HAMA (human anti-mouse antibodies). Pyritään välttämään vaikutusta esim. lisäämällä määritykseen ylimääräistä hiiren vasta-aineita (jotka eivät itse sitoudu mihinkään määrityksessä 

Kiintokantaja

Mahdollistaa immunomäärityksessä sitoutumattomien tekijöiden helpon erotuksen/pesun. Vaihtoehtoja esim. mikrotiitterilevyn kaivo tai magneettinen mikropartikkeli, jonka pinnalla on vasta-aineita 

Vaatimukset kiintokantajalle

• Matala taustasignaali mittaustavassa

• Matala epäspesifisen sitoutuminen pintaan

• Tehokas sitojavasta-aineen kiinnitys mahdollinen

  • Vasta-aine kiinnittyy vahvasti

  • Vasta-aine edelleen toimintakykyinen

  • Vasta-aine ei irtoa

• Mahdollsita pestä tehokkaasti 

Miten vasta-aineet voidaan kiinnittää kiintokantajaan

• Passiivisesti 

  • Inkuboidaan vasta-ainetta muovipinnan kanssa esim. yön yli

  • Kuluu paljon vasta-ainetta, josta suurin osa ei säily aktiviisena

• Streptavidiinin/biotiinin kautta

  • Vasta-aineeseen kiinnitetty biotiini sitoutuu erittäin voimakkaasti kiintokantajaan kiinnitettyyn streptavidiiniin

  • Voidaan käyttää pienempää määrä vasta-ainetta

Heterogeeniset ja homogeeniset immunomääritykset

• Heterogeeniset immunomääritykset vaativat sitoutumattomien tekijöiden erottamisen sitoutuneista tekijöistä, esim. kiintokantajaa hyödyntäen 

  • Kilpaileva ja ei-kilpaileva immunomääritys

• Homogeeniset immunomääritykset eivät vaadi sitoutumattomien tekijöiden erottamista sitoutuneista tekijöistä

  • Yksinkertaisempia ja nopeampi kuin heterogeeniset määritykset

  • Vaativat leimoja, joiden singaali muuttuu, kun vasta-aine sitoutuu analyyttiin 

Immunomääritysten leimatekniikat

• Radioaktiiviset leimat (isotooppileimat)

  • Vanhin, mutta eivät laajasti enää käytössä 

  • RIA - radioimmunoassay (kilpaileva)

  • IRMA - immunoradiometric assay (ei-kilpaileva) 

  • Mittauksissa käytetään tuikelaskentaa: Radioaktiivisuus muutetaan valoksi käyttämällä tuikeliuosta ja valo havaitaan netetuikelaskijalla

• Entsyymileimat 

  • Leimana käytettävä entsyymi kiinnitetään vasta-aineeseen tai analyyttii-analogiin

  • Entsyymi katalysoi reaktion, jossa substraatti muuttuu havaittavaksi tuotteeksi, esim. fluoresoivat aine, valoa tuottava reakiot, värillinen valoa absorboiva aine

  • Immunomääritykseen tarvitaan lisävaihe, jossa viimeisen pesun jälkeen lisätään substraattia ja reaktiota inkuboidaan havaittavan tuotteen muodostumiseksi → Entsyymileimalla toteutettua immunomääritystä kutsutaan ELISA-määritykseksi (leimana aina entsyymi)

  • Piparjuuriperoksidaasi (HRP), alkalinen fosfataasi (ALP)

• Fluoresoivat leimat

  • Molekyylin voi kiinnittää myös suoraan vasta-aineeseen/analyytti-analogiin

    • Ei tarvitse käyttä entsyymiä (fluoresoivat leimat pienempiä kuin entsyymit)

  • Ei-kilpaileva immunomääritys (IFMA)

  • Kilpaileva immunomääritys (FIA)

Entsyymileimojen hyötyjä ja haittoja

• Hyvin laajasti käytettyjä

• Turvallisia

• Tuottavat tehokkaasti signaalia (yksi entsyymi muuttaa monta substraattia)

• Isoja molekyylejä → Saattavat häiritä immunomäärityksen toimintaa

• Vaativat kontrolloituja olosuhteita → Muuten vaikea verrata. Kaikissa verrattavissa reaktioissa sama aika, lämpötila, pH,…

Primaarinen vasta-aine

• Hiiressä tuotettu monoklonaalinen vasta-aine

• Tunnistaa analyytin

• Kallis

Sekundaarinen vasta-aine

• Esim. kanissa tuotettu hiiren vasta-aineen tunnistava vasta-aine (= kanin anti-hiiri vasta-aine)

• Edullinen, helposti saatavilla 

• Vaatii ylimääräisen inkubaation → Ei käytössä diagnostiikassa 

• Sekundaarinen vasta-aine leimareagenssinä: Epäsuora ELISA

Leimojen havainnointi - spektrofotometria

• Spektrofotometria perustuu valon mittaukseen

• Molekyylit, joissa on konjugoituneita kaksoissidoksia (joka toinen sidos kaksoissidos) absorboivat valoa voimakkaasti 

  • Mitä enemmän konjugoituneita sidoksia, sitä korkeampi molaarinen abrosptiokerroin

  • Mitä pidempi konjugoitunut järjestelmä, sitä pienemmän energian fotoneita pystytään absorboimaan

• Absorbanssi mitataan vertaamalla näytteen läpäisevän valon määrää vertailunäytteeseen (referenssiin), joka ei sisällä absorboivaa molekyyli 

  • Mitä enemmän analyyttiä, sitä enemmän entsyymiä, sitä enemmän sinistä tuotetta, sitä korkeampi absorbanssi

Leimojen havainnointi - Fluorometria

• Fluorometriassa mitataan fluoresenssia

• Kun immunomäärityksessä käytetään fluoresoivia leimoja, on tärkeää pystyä mittaamaan fluoresenssisignaalin (emittoidun valon) voimakkuutta

• Fluoresenssin singaali on kasvava valomäärä tietyillä aallonpituuksilla → Helpompi erottaa pieniä pitoisuuksia kuin absorbanssin kanssa → Herkemmät määritykset → Voidaan mitata myös hyvin suuria valomääriä (riippuen detektorista) → Mittausalue laajempi

• Mitä enemmän analyyttiä, sitä enemmän entsyymiä, sitä enemmän fluoresoivaa tuotetta ja sitä korkemapi fluoresenssi

Autofluoresenssi

Immunomäärityksessä esiintyvät muut molekyylit, jotka voivat fluoresoida mitattavilla aallonpituuksilla (esim. vasta-aineet, näytteen ja puskurin komponenetit, mikrotiitterilevyn muovi)

Nukleiinihappojen tunnistusmenetelmät

• Yleisimmät nukleiinihappojen tunnistusmenetelmät perustuvat nukleiinihapposekvenssien spesifiseen monistukseen PCR-reaktiossa ja sekvsenssin monistumisen havaitsemiseen fluoresoivalla leimalla

• Menetelmien pohjana nukleiinihappojen emästen sitoutuminen komplementaarisiin emäksiin

Mitä PCR reaktioon tarvitaan?

• Kohdesekvenssille spesifiset alukkeet (primers)

  • Monistettavan sekvenssialueen (amplikonin) päille komplementaariset oligonukleotidit (vastinjuosteiden 3’ päät)

• Nukleotidit

• Polymeraasi-entsyymit (esim. Thermus aquaticus bakteerista → Taq-polymeraasi)

  • Rakentaa uuden juosteen kohdesekvenssin mukaisesti 5’ → 3’ suuntaan

• PCR-puskuri

  • Sisältää polymeraasin aktiivisuudelle suotuisat olosuhteet tarjoavat reagenssit

PCR-syklin vaiheet

• Lämpötila nostetaan 95 asteeseen, vastinjuosteet eroavat (denaturoituminen)

• Lämpötila lasketaan 55 asteeseen, alukkeet kiinnittyvät kohdesekvenssiin (sitoutuminen)

• Lämpötila nostetaan 72 asteeseen, polymeraasi rakentaa nukleotideistä uuden juosteen kohdesekvenssin mallin mukaisesti (pidentyminen)

• Sekvenssimäärä tuplaantuu joka syklissä

Mitä SYBR Green on?

• SYBR Green on molekyyli, joka fluoresoi kiinnittyessään kaksinauhaiseen DNA:han

• Mitä enemmän dsDNA:ta (double stranded DNA) läsnä, sitä enemmän fluoresenssia

• Pystytään käyttämään hyväksi PCR-reaktion reaaliaikaisessa seurannassa

  • Fluresenssisignaali nousee PCR-reaktion aikana kaksinauhaisen kohdesekvenssin monistuessa

PCR:n vaiheet

• Eksponentiaalinen vaihe

  • Kaksinauhaisen kohdesekvenssin määrä tuplaantuu joka syklissä

  • Monistumistehokkuus hyvin luotettavaa

• Lineaarinen vaihe

  • Reaktio hidastuu, kun alukkeet ja nukleotidit eivät riitä enää tehokkaaseen monsitumiseen ja entsyymin aktiivisuus heikkenee

  • Paljon vaihtelua monistumistehokkuudessa

• Tasoittumisvaihe

  • Alukkeet ja nukleotidit loppuvat, entsyymit ei enää toimi

  • Reaktio pysähtyy, ei synny enää uusia kaksinauhaisia tuotteita

• Loppuvaiheessa signaalitasojen erot eivät kerro luotettavasti kohdesekvenssin alkuperäisestä määrästä → Vain eksponentiaalisen vaiheen signaalitasot luotettavia

Mitä qPCR (quantitative PCR) mahdollistaa?

• Mahdollistaa tietyn DNA-kohdesekvenssin (tai RNA-kohdesekvenssin kun yhdistettynä käänteiskopiointiin) määrän selvittämisen näytteessä, esim.

  • Bakteeri- tai virus-DNA:n läsnäolo näytteessä (infektiodiagnostiikka, elintarviketurvallisuus…)

  • Tietyn geenin läsnäolo näytteessä (bakteerien antibioottiresistenttiys, sinilevän toksisuus)

  • Tietyn geenivariantin läsnäolo näytteessä (perinnölliset sairaudet)

  • Tietyn sekvenssin määrä näytteessä (esim. tietyn syöpään liittyvän mRNA:n tai microRNA:n esiintyminen veressä, veren virusmäärä, proteiinien ekspressiotasojen selvittäminen eri kudoksissa…)

Miten kohdesenvenssin määrä näytteessä vaikuttaa PCR-reaktioon?

Mitä enemmän PCR-reaktioon laitetaan aluksi näytteessä kohdesekvenssiä, sitä nopeammin havaittava kohdesekvenssin kopiomäärä saavutetaan PCR-reaktion aikana. Mitä enemmän kohdesekvenssiä on läsnä reaktiossa, sitä aiemmin signaali nousee kynnyssignaalitason yli eli sit pienempi kynnyssykli

qPCR: Kynnyssignaalitaso (kynnyssignaali)

Signaalitaso, joka on erotettavissa taustasignaalitasosta reaktion eksponentiaalisessa vaiheessa

qPCR: Kynnyssykli

• PCR-reaktion sykli, jossa mitattu signaali ylittää kynnyssignaalitason

• Kynnyssyklin avulla pystytään määrittämään, kuinka monta kopiota kohdesekvenssiä oli näytteessä, kun sitä verrataan standardien kynnyssykleihin (standardeissa tunnetut määrät kohdesekvenssiä)

qPCR:n standardit

• Liuokset, joissa tunnettu määrä määritettävää DNA:ta

• Analysoidaan omissa reaktioputkissaan

• Tulosten perusteella voidaan tehdä standardikuvaaja, jonka perusteella voidaan päätellä analysoitavan näytteen sisältämä DNA-määrä

FRET

Ilmiö, jossa viritetty fluoresoiva molekyyli (luovuttaja) siirtää energiansa toiselle, läheisessä kontaktissa olevalle molekyylille (vastaanottaja) ilman fotonin emittointia. Käytetään hyödyksi qPCR:n leimateknologioissa

Hydrolyysikoettimet (“TaqMan-koettimet”)

• TaqMan-koetin: 

  • Oligonukleotidi, jonka sekvenssi komplementaarinen kohdesekvenssin toisen juosteen kanssa

  • Toisessa päässä kiinni fluorofori ja toisessa kiinni sammuttaja

• Kun fluorofori ja sammuttaja kiinni koettimessa, sammuttaja sammuttaa fluoroforin fluoresenssisignaalin

• Kun koetin kiinnittyy kohdejuosteeseen ja polymeraasi alkaa muodostaa uutta juostetta alukkeesta lähtien, polymeraasi pilkkoo koettimen

• Kun polymeraasi pilkkoo koettimen → Fluorofori tuottaa fluoresenssisignaalia

• Kohdesekvenssien määrän lisääntyessä yhä useampi koetin pääsee sitoutumaan ja pilkkoutumaan jokaisessa syklissä

• Fluoresenssisignaali kasvaa kohdesekvenssin monistuessa

Mitä hydrolyysikoettimet (“TaqMan-koettimet”) lisäävät qPCR-testeihin?

Ne lisäävät spesifisyyttä qPCR-testeihin

• SYBR Greenin kanssa alukkeiden täytyy olla sopivalla etäisyydellä toisistaan, jotta monistumista voi tapahtua → Silti voi syntyä epäspesifisiä tuotteita, esim. “primer-dimer” (alukedimeeri)

• TaqMan-koettimilla täytyy lisäksi löytyä alukkeiden väliltä koettimelle spesifinen sekvenssi, jotta fluoresenssisignaali nousee

Sisäinen monistumiskontrolli

• Jotta qPCR-tulokset ovat luotettavia, monistumisreaktion on toimittava moitteettomasti

• Joissain näytteistä voi olla PCR-reaktiota inhiboivia tekijöitä, jotka häiritsevät monistumsita

• Tämän huomaamiseksi TaqMan-reaktiossa voidaan käyttää sisäisiä monistumiskontrollia

  • Näytteeseen lisätään sekvenssi, joka monistuu omilla alukkeilla ja jonka oman koettimen fluorofori antaa signaalin eri aallonpituudessa kuin varsinaisen kohdesekvenssin koettimen fluorofori

Nukleiinihappoanalytiikan haasteita

• PCR on erittäin herkkä havaitsemismenetelmä

  • Yksi kohdesekvenssi näytteessä voi saada aikaan positiivisen tuloksen

  • Reaktion valmistelussa on kiinnitettävä erityistä huomiota huolellisuuteen ja puhtauteen

  • Suosittava suljetun putken menetelmä (PCR-putkea ei avata reaktion jälkeen) kuten TaqMan tai SYBR Green qPCR-menetelmät

Sensori

Havaitsee ja ilmaisee tiettyä seikkaa ympäristön tilassa (tai tämän seikan muutoksia). Esim. lämpömittari, hämäräkytkin, paineanturi,…

Biosensori

Hyödyntää biologisia komponentteja havainnoinnissa

Biosensorin rakenne

• Biologinen tunnistin (bioreseptori): Vastaa analyytin spesifisestä tunnistuksesta

• Muunnin: Tuottaa sähköisen signaalin biotunnituksen seurauksena → Muuntimen jälkeen tarvitaan signaalin käsittelyä tuloksen ilmaisemiseksi

Biosensori: Tunnistimen tyyppejä

• Affiniteettiin perustuva (spesifinen sitoutumistapahtuma):

  • Vasta-aine

  • Antigeeni

  • Nukleiinihappo

• Biokatalyyttinen (katalysoi spesifistä reaktiota):

  • Entsyymi

  • Solu

  • Organelli

Biosensori: Muuntimen tyyppejä

• Elektrokemialliset muuntimet

  • Amperometrinen: Havaitsee muutoksen sähkövirrassa, kun jännite pysyy vakiona

  • Potentiometrinen: Havaitsee muutoksen jännitteessä, kun virta pysyy vakiona

  • Konduktiometrinen: Havaitsee muutoksen johtavuudessa kahden elektrodin välillä

• Optinen muunnin

  • mm. muutokset valon sironnassa tai pintaplasmoniresonanssi-ilmiössä

• Pietsoelektrinen muunnin (massamuunnin)

  • Kvartiskristallin oskillointitaajuus muuttuu, kun molekyyljeä sitoutuu pintaan

• Lämpötilaan perustuva muunnin

  • Eksotermiset tai endotermiset reaktiot

Kerro ELISA-määrityksen toiminta

Immunologinen testi, jolla voidaan havaita ja mitata esim. antigeenejä tai vasta-aineita biologisesta näytteestä. ELISA perustuu antigeenin ja vasta-aineen spesifiseen sitoutumiseen.

Testissä näyte asetetaan kuoppalevylle, jonka pinnalle on kiinnitetty esim. antigeeni tai vasta-aine. Kun lisätään näyte, amdhollinen vasta-aine tai antigeeni sitoutuu pintaan. Tämän jälkeen lisätään entsyymillä leimattu tunnistusvasta-aine, joka sitoutuu spesifisesti testattavaan molekyyliin. Lopuksi lisätään entsyymin substraatti, joka reagoi ja muodostaa värillisen lopputuotteen. Muodostuvan värin voimakkuus mitataan, ja se kuvaa testattavan aineen määrää näytteessä 

ELISA-testissä värillisten kuoppien määrä ja voimakkuus kertovat suoraan analysoitavan molekyylin konsentraation

Selitä glukoosibiosensorin toiminta

• Sensorissa on entsyymi (yleensä glukoosi-oksidaasi), joka katalysoi glukoosin hapettumisen. Tämä reaktio tuottaa sähköisen signaalin, joka on verrannollinen glukoosin määrään. Signaali muunnetaan sähköiseksi mittauksella elektrodilla

• Mittaus tapahtuu ihon alla kudosnesteestä, josta glukoosi diffundoituu

• Tieto glukoosipitoisuudesta lähetetään langattomaksi lähettimeen tai lukulaitteeseen

• Käyttäjä saa ajantasaisen arvon glukoosista ja voi seurata muutoksia reaaliajassa

Mistä biosensorin spesifisyys riippuu?

• Biosensorin spesifisyys mitattavalla analyytille riippuu biologisen tunnistimen spesifisyydestä

• Esim. glukoosisensorien kanssa ollut ongelmia, kun sensori reagoinut maltoosi-sokeriin

Kvalitatiivinen määritys

• Luokitteleva määritys

• Selvitetään, onko määritettävä molekyyli läsnä näytteessä vai ei

• Tulos positiivinen tai negatiivinen

  • Vaikka määrityksen tulos olisi negatiivinen, voi analyyttiä silti olla alle määritysrajan (esim. visuaalisesti luettava huumetesti)

Kvantitatiivinen määritys

• Mitattava määritys

• Selvitetään määritettävän molekyylin tarkka määrä tai pitoisuus näytteessä

• Tulos numeroarvo

• Kvantitatiivisella testilläkin on mittausrajat joiden ulkopuolella tulos ilmaistaan “alle määritysrajan” tai “yli määritysrajan”

Analyyttinen spesifisyys

Määrityksen kyky tunnsitaa oikeaa analyyttiä ja olla tunnistamatta muita samankaltaisia molekyylejä 

Analyyttinen herkkyys, analyyttinen sensitiivisyys

• Määrityksen kyky mitata hyvin pieniä pitoisuuksia analyyttiä luotettavasti

• Käytetään myös termiä määritysraja (limit of detection)

Kalibraattorit, standardit

• Liuokset, joissa on tunnettu pitoisuus mitattavaa analyyttiä

• Luovat suhteen mitatun signaalin ja pitoisuuden välille = kalibraatiosuora, standardisuora

• Suoran yhtälön avulla saadaan laskettua näytteen analyyttipitoisuus näytteen antamasta signaalitasosta

  • Pitoisuus pitäisi olla johdettavissa laajalti tunnutettuun vertailumateriaaliin, jonka pitoisuus on varmistettu luotettavimmalla menetelmällä

Minkälainen standardisuora on ei-kilpailevissa immunomäärityksissä

Ei-kilpailevilla immunomäärityksillä standardisuora usein symmetrinen tai epäsymmetrisen sigmoidinen → Suoran sovitukseen käytetään 4 ja 5 parametrin logistisia malleja

Toistotarkkuus

• Kuinka lähellä saman näytteen toistettujen analyysien tulokset ovat toisiaan? = Kuinka luotettava tulos on?

• Määritetään toistomittausten keskihajonnan ja keskiarvon suhteesta = Variaatiokerroin CV% (Keskihajonta/keskiarvo x100%) → Mitä pienempi, sitä parempi toistettavuus määritys on eli sitä luotettavampi määritys

• Vaihtelee määrityksissä eri näytepitoisuuksilla

  • Toistotarkkuus huononee, kun mennään hyvin mataliin ja hyvin korkeisiin pitoisuuksiin

  • Hyväksyttävä toistotarkkuuden raja määrittelee määrityksen mittausalueen

Toteamisraja, määritysraja

• Kuvastaa määrityksen herkkyyttä:

  • Kuinka pienen analyyttipitoisuuden määritys voi havaita luotettavasti?

  • Kuinka pienen analyyttipitoisuuden määritys voi mitata tarkasti?

• Herkkyyttä voidaan kuvata erilaisilla termeillä, jotka voidaan laskea eri tavoilla: analytical sensitivity, functional sensitivity

Analyyttinen herkkyys (Analyyttinen toteamisraja)

Analyyttipitoisuus, joka standardisuoralla vastaa signaalitasoa, joka saadaan laskemalla nollanäytteen toistomittausten signaalien keskiarvo + 3x(nollanäytteen toistomittausten signaalien keskihajonta)

Funktionaalinen herkkyys (Toiminnallinen määritysraja)

Pienin analyyttipitoisuus, jossa pitoisuuden CV% (variaatiokerroin) on 20%

Oikeellisuus

• Kuinka lähellä menetelmän antamat tulokset ovat oikeaa tulosta? Onko mitattu tulos oikea vai vääristynyt?

• Määritetään toistomittausten keskiarvon ja “oikean” vertailuarvon prosentuaalisena erona = poikkeama ((mitattu pitoisuus - oikea pitoisuus)/oikea pitoisuus x100)

• Mitä pienempi poikkeama, sitä parempi oikeellisuus

Takaisinsaanto tutkimus (recovery study)

• Oikeellisuutta selvitetään myös tämän avulla

  • Lisätään näytteeseen tunnettu määrä analyyttiä ja katsotaan, vastaako mitattu tulos odotettua nousua pitoisuudessa

  • Käytetään myös “matriisivaikutus” tutkimuksiin

Matriisivaikutus

• Näytemateriaalin aiheuttama häirintä määritykseen

• Näytteen muiden komponenttien kuin analyytin vaikutus määrityksen tulokseen

• Aiheuttaa tulosten laskua tai nousua

• Esim. verrataan seerumia ja eri tavalla antikoaguloituja plasmojä → mitkä niistä sopivat määritysken näytemateriaaleiksi

Toistotarkkuudeen ja oikeellisuuden haasteet

• Ongelmia määritysken toistettavuuteen voivat aiheuttaa esim.

  • Huolimattomasti toteutettu pipetointi

  • Häiriöt levypesurissa

  • Huonosti sekoitetut reagenssit (esim. leimavasta-aine sekoitettu huonosti puskuriin)

• Oikeellisuuteen vaikuttava määrityksen poikkeama/systemaattinen virhe voi aiheutua esim.

  • Virheellisestä kalibroinnista: Käytettyjen standardien/kalibraattoreiden pitoisuudet eivät pidä paikkaansa

  • Menetelmän puutteellisesta validoinnista tai väärästä käytöstä: Esim. käytetään näytteenä veren seerumia kun pitäisi käyttää plasmaa

Määrityksen ja testin ero

Määritys viittaa menetelmään. Testi viittaa määrityksen käyttöön tiettyyn tarkoitukseen

Mihin In vitro diagnostiikan testit/määritykset voivat perustua?

• Bioteknisiin järjestelmiin

  • Immunomääritykset

  • Nukleiinihappomääritykset

  • Entsyymivälitteiset määritykset (esim. glukoosisensori)

• Elektrokemiallisiin määrityksiin (esim. pH, pO2, Na, K, Ca,…)

• Nestekromatografiaan (esim. lääkeaineet, vitamiinit)

• Elektroforessiin (esim. seerumin proteiinit)

• Massaspektrometriaan (esim. lääkeaineet)

Mitkä solupohjaiset määritykset kuuluvat In vitro diagnostiikan testeihin/määrityksiin?

• Patogeenien viljely (tunnistus ja antibiottiresistenttiys)

• Verinäytteen hyytyminen (hyytymisaika)

• Kudosten mikroskooppitutkimus = histologia (esim. syöpäkasvaimet)

• Irrallisteen solujen/soluryppäiden mikroskooppitutkimus = sytologia (esim. syöpäsolut)

• Verisolujen tunnistus ja laskenta (verenkuva)

Mihin In vitro diagnostiikkan testejä voidaan käyttää lääketieteessä?

• Diagnoosin tekemiseen

• Sairauden vaikeusasteen määrittämiseen

• Sairauden etenemisen ennustamiseen = prognoosi

• Sairauden uusiutumisen havaitsemiseen

• Riskin ennustamiseen/sairauden välttämiseen terveellä ihmisjoukolla = seulonta

• Sairauden hoidon tehokkuuden seurantaan

• Hoitomenetelmän valintaan