20.3: Regeling van genexpressie in eukaryoten: transcriptionele controle (2e controle)

wat is 2e niveau van Rgeling van genexpressie in eukaryoten

transcriptionele controle

slide transcriptie verschillend in verschillende celtypes

verschil algemene en regulerende transcriptie factoren

• Algemeen: zijn nodig voor initiatie van de trancriptie van alle genen van een type RNA pol en binden aan de kernpromotor

• Regulerende transcriptiefactoren binden buiten de kernpromotor, niet essentieel om transcriptie te initiëren (regulerende functie)

voorbeelden van promotor proximale controle elementen

GC box / CAAT box / octameer

liggen stroomopwaarts van promotor

wat zal binden op silencer en enhancer equenties en waar liggen de

• Transcriptionele activator bindt op enhancer

• Transcriptionele repressor bindt op silencer

ze liggen stroomop- en -afwaarts

wat zijn insulator eiwitten

binden op insulator seq en verhinderen dat de activatoren en repressoren nog actief zijn voorbij een zeker punt

warkt een anhancer nog even goed als we deze verder weg zetten van de promotr

en als we deze stroomaf- ipv -opwaarts zetten

en als we deze omdraaien?

werkt in alle gevallen even goed

Wat is een reporter gen

Artificieel gen toegevoegd aan een bepaald celtype om activiteit van het gen te detecteren.

Vaak eiwitcoderende genen (coderen voor mRNA dat codeert voor een eiwit).

Bv GFP binnebrengen in een cel door het gen dat voor GFP codeert onder de promotor te zetten van het eiwit dat je wilt bestuderen.

bv lacZ gen

slide enhancers en silencers

Hoe werken enhancers

• Looping: ze vormen een lus, waardoor iets da heel ver van de promotor ligt deze toch kan regelen (insulators bepalen dan welke promotors al dan niet geregeld worden door de enhancer) doordat de transcriptionele activatoren via hun DNA bindend domein op de enhancer gaan zitten

• transcriptionele activatoren (DNA-bindingsdomein en activatiedomein) rekruteren co-activatoren (deze binden niet rechtstreek aan DNA want hebben geen DNA bindingscapaciteit)

• co-activatoren (bv histon modificerende enzymen, chromatine remodelleer complexen en / of mediator complex)

• de activatoren binden een mediator complex dat rechtstreeks bindt op de activatoren en de algemene transcriptie factoren

waar binden regulerende transcriptiefactoren

niet op kernpromotor, op controle elementen

brengen alle celtypes hetzelfe RNA pol, algemene transcriptiefactoren en regulerende transcriptiefactoren tot expressie?

algemene en RNA pol zijn hetzelfde

regulerende verschillen en kunnen overlappen

slide eukarytosiche expressie

zijn bij regulatorische transcriptiefactoren de 2 domein (DNA binden en activatie) afhankelijk van elkaar?

nee, zie experiment

voorbeelden van DNA bindingsdomeinen

• helix-turn-helix motief

• zink-vinger motief

• helix-lus-helix motief

• DNA bindende proteïnen met een leucine-zipper motief

waar komt helix-turn helix motief voor in bacteriën en eukarya

• bact: in lac en trp repressor, CAP, lambda faag repressor

• euk: homeotische transcriptiefactor

hoe werkt helix-turn-helix motief

• herkenninghelix: bindt een specifieke DNA seq in de grote groeve van de dubbele helix

• tweede helix: stabiliseert de configuratie door hydrofobe interacties met de herkenningshelix

wat is het zink vinger motief

alfa helix en bèta plaat bestaande uit 2 segmenten

Cys of His positioneren een Zn ion

bv steroidhormoonreceptor

bv TFIIIA (TF voor 5s rRNA gen) heeft 9 zinkvingers

wat is helix-lus-helix

korte alfa helix → lus → langere herkennings alfa helix

2 polypeptiden (identiek of verschillend) met elk een helix-lus-helix

de polypeptiden interageren door hydrofobe interacties

2-delig DNA bindend domein: gevormd door herkenningshelixen van elk polypeptide

wat is leucine zipper motief

leucines worden herhaald op beide peptiden en passen in elkaar

• twee alfa helices, elk met leucine (hydrofoob) op regelmatige afstand wikkelen rond elkaar en vormen een dubbele spiraal (ze vormen beiden een spiraal op zich maar draaien ook nog eens rond elkaar) (coiled coil)

• 2 identieke of verschillende polypeptiden

• gecombineerd met 2 bijkomende alfahelices die binden in major groeve van DNA, want Leu rits bindt niet op zichzelf

wat is een DNA respons element

bepaalde consensus DNA sequentie waarop een regulerende transcriptiefactor bindt en de expressie van dat gen regelt.

de regulerende TF zal enkel binden op het DNA respons element in respons vaneen bepaald signaal uit de omgeving of bij embryoneale ontwikkeling en dan alle genen met at DNA respons element gelijktijdig aanzetten of afzeetten

De genen met een bepaald DNA respons element ligeen verspreid over hele genoom opdeze manier kan de TF de expressie van niet naast elkaar gelegen genen coördineren

DNA respons elementen kunnen enkel behoren ror proximale controle elementen

DNA respons elementen kunnen behoren tot de prxomale controle elementen pf de enhancers/silencers

wat doen hormoonreceptoren

• bindt hormoon

• transloceert naar nucleus

• bindt hormoon respons element (HRE)

Hoe gebeurt de translocatie van een hormoon (H) naar de nucleus via een hormoon receptor (HR)

• hormoon

  • steroidhormonen (zijn vetoplosbaar en kunnen door PM gaan)

    • geslachtshormonen

      • testosteron

      • estrogenen

    • glucocorticoiden

      • cortisol

  • thyroidhormonen

    • schildklierhormoon T3

    • schildklierhormoon T4

• een vetoplsobaar hormoon kan door de PM diffunderen en in de cel raken

• H zal in competitie treden met Hsp voor binding aan HR

• Hsp dissocieert en bindt aan HR

• na binding gaat naar kern (conformatieverandering waardoor NLS vrijkomt) (Hsp blokkeerde de NLS)

• HR met gebonden H bindt op HRE

  • bv estrogen respons element

  • bv testosteron respons element

  • clucocorticoid respons element

  • …

lees even

steroidhormoon bindt steroidhormoon receptor (zinkvinger TF, alloserisch eiwit) in het cytosol, gaat naar kern en bindt HRE (hormoon respons element)

steroidhormoon receptor kan 2 soorte DNA respons elementen binden: een activerende of een inhiberende respons element

Hoe werkt DNA respons element voor CREB

• cAMP respons element (CRE) ligt in gene waarvan de transcriptie geactiveerd wordt door cAMP

• cAMP acitveert PKA

• PKA fosforyleert CREB

• rekrutering van co-activator CBP = CREB binding = histon acetyltransferase

• acetylatie van histonen

slide CREB

Hoe werkt DNA respons element voor STAT

• Interferon behoort tot de cytokines en wordt gesecreteerd door cellen na een virale infectie. Door die interferon worden bepaalde genen aangezet (= interferon respons)

• Interferon (glycoproteïne) bindt celmembraan receptor

• Na binding ligand → dimerisatie waarbij JAK kinase (Janus kinase → intracellulair proteïnekinase) zijn receptor fosforyleert.

• Rekrutering STAT eiwit, bindt aan gefosforyleerde receptor. STAT is hier de regulerende TF (signal transducer and activator of transcription)

• JAK fosforyleert STAT

• Gefosforyleerde STAT dimeriseert (dan pas wordt een NLS gevormd)

• STAT dimeer gaat naar kern

• STAT bindt ISRE (interferon stimulerend respons element) en activeert transcriptie

voorbeeld van een gen dat een eiwit tot expressie brengt met een ISRE

APOBEC3G (= deoxycytidine deaminase)

Hoe werken DNA respons elementen voor Heat shock TF (HSTF)

• HSTF is een monomeer en inactief in cytosol

• HSTF wordt geactiveerd door warmte (conformatieverandering waardoor NLS gevormd wordt), transloceert naar de kern en bindt als een trimeer op HSRE (heat shock respons element)

• fosforylering van de gebonden HSTF leidt tot activatie van transcriptie

• heat shock genen / stress respons genen coderen voor bv de moleculeire chaperone Hsp70 en hebben een HSRE in hun gen

slide schema

Wat zijn homeotische transcriptiefactoren

• homeotische genen coderen voor homeotische TF die binden op specifieke DNA sequenties

• Homeobox (180bp) codeert voor homeodomein (= 60AZ’en, helix-turn-helix) dat DNA bindend domein is

• Homeotische TF activeren of inhiberen genen die belangrijk zijn bij de embryonale ontwikkeling en het bepalen van het lichaamsplan (ontwikkeling lichaamsdelen) (zorgen dat de juiste genen aan en uit gezet worden zodat juiste lichaamsdelen worden gevormd).

slide homeotische genen

hoeveel HOX loci bij mens

4

wat is redundantie

functie van een bepaald eiwit kan overgenomen door een ander eiwit in de cel

(bv bij HOX genen: als a1 van HOXa is uitgeschakeld kan b1 de functie overnemen, hierdoor is de mutatie niet zo dramatisch als in drosophila, die hebben maar 1 HOX locus)

mens en muis hebben 4 HOX loci, de genen liggen in de volgorde van hoofd naar staart

vb van een mutatie in HOX genen (HoxD13 locus)

synpolydactyly

tgv de mutatie in HoxD13 → vervroegd stopcodon → verkort eiwit → vingers en tenen bv ontwikkelen niet zoals normaal

wat wordt bedoeld met homeotische TF zijn heel sterk geconserveerd

HOX eiwitten vertonen bij drosophila en mens heel grote overeenkomsten

A1 ligt aan de 3’ / 5’ kant van de HOXa cluster en komt anterior / posterior tot expressie

3’, anterior

wat betekent collineariteit

de genen liggen in een volgorde op het chromosoom

de volgorde van de genen op het chromosoom komt overeen met de expressie van de genen van anterior naar posterior

liggen de 4 HOX loci bij mens op hetzelde chromosoom

nee

Vergelijk de activatie van genen in bacteriën met de eukaryoten.
- Wat is gelijkend?
- Wat is verschillend?

= zowel bij PROK als EUK wordt de expressie van genen geregeld door regulerende DNA-bindende eiwitten.

Deze DNA-bindende eiwitten kunnen al dan niet allosterisch geregeld worden. Voorbeelden van DNA-bindende eiwitten in PROK zijn sigmafactoren, lac repressor, trp repressor en CAP; in EUK zijn het een groot aantal verschillende regulerende transcriptie factoren: transcriptionele activatoren en transcriptionele repressoren.

≠ de ‘default’ (standaard) transcriptie status van de genen is verschillend
in PROK is de default status van de genen de ON na binding van het RNA pol met de sigmafactor op de promotor.

De genen kunnen wel actief worden
uitgeschakeld door binding van een repressor op de operator sequenties in een operon (geen of weinig transcriptie).

We hebben ook één voorbeeld van positieve regulatie besproken waarbij binding van het CAP eiwit op de CAP sequentie de transcriptie van het lac operon stimuleert als de lac repressor niet gebonden is.

Ook typisch voor de PROK is de gelijktijdige regulatie van expressie van de genen die in één operon liggen. in EUK is de default status van de genen een basale transcriptie (lage transcriptie, door binding van de algemene transcriptiefactoren en RNA pol op de promotor.

Via binding van één of meerdere transcriptionele activatoren op een enhancer sequentie(s) stijgt de transcriptie (ON).

Daarentegen zorgen de binding van één of meerdere transcriptionele repressoren op de silencer sequentie(s) dat de transcriptie zal dalen en/of volledig
uitgeschakeld (OFF).

Het transcriptieniveau van een gen wordt in de eukaryote cel bepaald door totale hoeveelheid gebonden transcriptionele activatoren en repressoren die dat gen regelen.

Dit combinatorisch systeem maakt cel-type specifieke expressie mogelijk. Ook typisch voor eukaryoten is de gelijktijdige regulatie van genen die verspreid liggen over heel het genoom door binding van regulerende transcriptie factoren op de
DNA respons elementen.