H1 - HISTOLOGISCHE TECHNIEKEN

histologie

studie van de normale microscopische structuur van levende organismen

organisatieniveaus

• supra-macroscopisch

• macroscopisch

• microscopisch; LM

• sub-microscopisch; EM

• moleculair

van cel tot mens

• cel

• weefsel

• orgaan

• orgaansystemen

• mens

types weefsel (4)

• epitheel

• bind

  • eigenlijk

  • bloed

  • kraakbeen

  • bot

• spier

• zenuw

histologische technieken

• weefsels en organen observeerbaar maken voor LM of EM

• problemen;

  • weinig contrast in biologisch materiaal, alles ongeveer dezelfde kleur

  • weinig licht (elektronen) doorlatend, weefselstukjes of -sneetjes te dik

stappen weefselbewerking (4)

• fixeren

• inbedden

• snijden

• kleuren (LM) / contrasteren (EM)

fixeren

• bewaart weefselstructuren adhv eiwitdenaturatie; stopt bacteriële en autolytische afbraak

• permeabiliseren van celmembraan

• harder en poreuzer maken van het weefsel

• mgh

  • chemische fixatie; immersie/perfusie weefsel met fixatief

  • koude fixatie; invriezen

inbedden

• gefixeerd materiaal omwikkelen en doordrengen met inbedmiddel

  • vloeibare vorm; weefsel indringen

  • vaste vorm; na indringing wordt hard → materiaal snijdbaar in dunne plakken (coupes)

• vb. paraffine (LM), harsen & plastics (LM + EM)

artefacten

• veranderingen die tijdens de fixatie/inbedding in een weefsel ontstaan en afwijken van de in vivo situatie

• vb. lacune in kraakbeen; lacunes in bot zijn daarentegn wel echt!

ontwatering v. weefsel

• probleem; inbedmiddelen zijn hydrofoob = lossen niet goed op in water; maar weefsel bevat veel water

• opl; ontwatering weefsel gebeurt met oplopende alcoholbaden

• clearing v. alcohol adhv tolueen

samengevat

• fixatie; denaturatie eiwitten

• dehydratatie; ontwatering v. weefsel

• clearing; v. alcohol

• infiltratie; vb. gesmolten paraffine

• inbedden; uitharden

• bijsnijden

snijden

• zo dun mogelijke coupes → microscoop

• hoe harder inbedmiddel, hoe dunner coupes

  • paraffine; (LM)

  • harsen / plastics (afh. dikte; LM/EM)

kleuring

• kleurcontrast in coupes laag; visualisatie van cellen, celbestanddelen en extracellulair materiaal in weefsel

• probleem; kleurstoffen zijn vaak waterige oplossingen → eerst coupes deparaffineren met tolueen

kleuringstechnieken

• HE-kleuring

• PAS-kleuring

• Feulgen-kleuring

• enzymhistochemie

• autoradiografie

• immunohistochemie (IH)

• in-situ hybridisatie (ISH)

HE-kleuring

• hematoxyline (blauwe, basische kleurstof) → gaat naar zure plaasten

• eosine (roze, zure kleurstof) → gaat naar basische plaatsen

• 2 componenten;

  • chromofoor = kleurdrager

  • auxochroom = maakt kleurstof wateroplosbaar + bindt chromofoor aan weefsel

• pH van kleurmilieu zeer bepalend voor resultaat van de kleuring; belang van iso-elektrisch punt (IEP)

• niet mogelijk bij sacchariden en lipiden

HE-kleuring — metachromasie

• fout die ontstaat bij kleuring; paarse kleur

• zou blauw moeten zijn; hoge densiteit zure groepen → dimeren → paarse kleur wordt gereflecteerd

• niet afkomstig van blauw en roze samen!!

• vb. zure glycosaminoglycanen (GAGs) in kraakbeen

PAS-kleuring

• visualiseren van een specifieke chemische groep in cellen en weefsels; aantonen v. polysacchariden

• period acid-schiff

• glycolgroepen → aldehydegroepen door oxidatie door perjoodzuur; aldehydegroepen reageren met kleurloos Schiff-reagens → paarsrode kleur

HE- vs. PAS-kleuring

• epitheel dunne darm

• HE-kleuring; mucines kleuren amper

• PAS-kleuring; polysachariden worden sterk gekleurd

Feulgen-kleuring

• visualiseren van een specifieke chemische groep in cellen en weefsels; aantonen v. DNA

• hydrolyse van DNA door zoutzuur → purinebasen komen vrij van desoxyribose → ontstaan van aldehydegroepen op desoxyribose → reageren met kleurloos Schiff-reagens → paarsrode kleur

enzymhistochemie

• visualiseren van enzymale activiteit

• toevoegen van een specifiek substraat

• vorming van een waarneembare neerslag (weinig lichtdoorlaatbaar)

• vb. aantonen van dehydrogenasen, fosfatasen, peroxidasen

autoradiografie

• visualiseren van metabole activiteit

• toevoegen van een radioactief gemerkte precursor = stof die door organisme verwerkt moet worden

• coupes in contact brengen met fotografische emulsie

• vb. aantonen van DNA-synthese in cellen:

  ³H-thymidine toevoegen in overmaat → aangemaakt DNA wordt radioactief gelabeld

immunohistochemie (IH)

• visualiseren van specifieke moleculen via antigen- antilichaam-binding

• antilichaam voorzien van een merker

• LM, FM of EM

in-situ hybridisatie (ISH)

• visualiseren van specifieke nucleotidenvolgorden

  in DNA en RNA

• DNA/RNA-probes voorzien van een merker

IH & ISH

• fluorescerende merkers (fluorochromen)

• fluorescentiemicroscopie (FM)

  • gebruik makend van filters (excitatiefilters/sperfilters)

  • excitatielicht met kortere golflengte (bv. blauw) → emissielicht met langere golflengte (bv. groen) door fluorochroom

  • achtergrondkleuring (counterstain) nodig

  • fluorescerende delen van het preparaat lichten op tegen een donkere achtergrond

contrasteren

• EM

• kleurcontrast in coupes laag; visualisatie van cellen, celbestanddelen en extracellulair materiaal in weefsel

• densiteitsverschillen verhogen = contrasteren

• toevoegen van zware metalen → toename contrast

• foto; cel uit het bloed (ingebed in hars; fixatie met OsO4; contrasteren met Ur-acetaat en Pb- citraat)

observatiemethoden

• lichtmicroscoop (LM) — tot 1000x

  • helderveld

  • fasecontrast

  • interferentiecontrast

  • fluorescentiemicroscopie (fluorchromen)

  • confocale microscoop

• elektronenmicroscoop — tot 100.000x

  • TEM

  • SEM

• virtuele microscopie — 40x

resolutievermogen (RV)

• = afstand tussen 2 dicht naast elkaar gelegen punten die nog juist door het toestel worden onderscheiden

• hoe kleiner RV, hoe gedetailleerder, hoe hoger de kwaliteit