Molekularbiologie Grundlagen

DNA

Desoxyribonukleinsäure (Ribose → 5C-Zucker & Desoxy → eine OH-Gruppe fehlt)

aus:

1. Desoxyribose

2. Stickstoffhaltige Base (A, T, C oder G)

3. Phosphatrest (dort interagieren einzelne Nukleotide)

→ insgesamt eher negativ geladen (bewegt sich auf Gelelektrophorese in Richtung + Pol)

→ Basen allein eher positiv (interagieren mit negativ gelagenen Seitengruppen von Proteinen)

Basen

A & G → Purine

C & T → Pyrimidine

A = T & C ☰ G (Wasserstoffbrückenbindungen)

bei Gelelektrophorese & Färbung mit Ethidiumbromid schiebt es sich horizontal zwischen 2 benachbarte Basenpaare

Leserichtung DNA

immer von 5´ zu 3´ wobei;

Matritze abgelesen von 3´ zu 5´

neuer Strang synthetisiert von 5´ zu 3´

beide Stränge verlaufen antiparallel

Windung DNA

→ Superhelix, Supercoil → Zahl der Verdrillungen (negativ).

so entsteht Major- & Minor-Groove

Gen

ist eine Einheit vererblicher Informationen (ein Abschnitt im Genom). ABER nur ein kleiner Teil der genomischen DNA codiert wirklich für Protein

gibt noch:

repeated sequences: LINEs, SINEs, Transposons

unique sequences: v.a. Gene

Histon

Protein. Mehrere bilden Oktamer aus 4 verschiedenen Proteinen (2xH2A, 2xH2B, 2xH3, 2xH4), welches DNA kondensiert → DNA windet sich doppelt darum → Nukleosom

gibt noch Histon-H1 → kondensiert DNA weiter

Chromatin

Gesamtheit aus Histonen (allen) & DNA.

Unterteilt in Hetero- & Euchromatin. Wobei nur Euchromatin abgelesen werden kann. Heterochromatin ist dicht gepackt.

Kann durch epigenetic editing (an N-Termini der Histone) ineinander überführt werden, wobei sich Inaktivierung von HC auf benachbarte Gene übertragen kann.

Nukleolus

Bereich der Ribosomen-Synthese im Nukleus.

Centromer

Bindestelle für 2-Chromatid-Chromosomen im Metaphasechromosom & Ansatzpunkt für Spindelapparat.

Dort Wiederholung von 171 Basen → Satelliten-DNA

Telomer

schützt Chromosomenden. Satelliten-DNA aus TTAGGG. T-Loop außen, D-Loop innen, aufgefaltet.

Proteine

ist Polypeptidkette (aus Aminosäuren) mit spezifischer Faltung

Primärstruktur: Abfolge der AS

Sekundärstruktur: ob alpha-Helix oder beta-Faltblatt (wie sich kleine Bereiche auffalten)

Tertiärstruktur: definitive 3D-Struktur

Quartiätstruktur: Polymer aus mehreren Proteinen

Kinase

Enzym, welches Phosphat überträgt (meist von ATP auf Zielmolekül)

DNA-Bindeproteine

haben negativ geladene Seitengruppen, um mit positiv geladenen Basen zu interagieren

& meist Helix-turn-Helix-Motiv, welches in Groove passt.

Zinkfinger

ist DNA-Bindeprotein aus 25 AS, kann Zink einlagern & immer 3 Basen selektiv erkennen.

→ mehrere Zinkfinger koppeln, um spezifische, bekannte Zielsequenz anzusteuern

heute CRISPR

TALENs

ist DNA-Bindeprotein aus 2 alpha-Helices & 34 AS, 12 & 13 AS definieren, welche Base es erkennt.

→ viele TALENs koppeln, um spezifische, bekannte Zielsequenz anzusteuern

heute CRISPR

TFs (Transkriptionsfaktoren)

sind DNA-Bindeproteine, sie aktivieren benachbarte Gene.

DNA-Replikation

DNA klont sich schnell & genau (1 von 1 mrd. Basen falsch).

macht DNA-Polymerase. Braucht Template, Start (oriC), Primer & freie Nukleotide (bei Verknüpfung werden 2 Pyrophosphate der Base abgespalten).

DNA-Polymerase

Enzym, welches DNA synthetisiert. Gibt 5 verschiedene:

• DNA-Pol. I: für Reparatur

• DNA-Pol. III: für Replikation

DNA-Polymerase synthetisiert 5′ → 3′

Primase

Enzym, welches kurzen RNA-Primer synthetisiert

Initiation der Replikation

1. Helikase (Hexamer) → öffnet dsDNA & setzt sich auf einen der Stränge

2. Single-strand-binding-Proteine → stabilisiert Einzelstränge (verhindern, dass komplementäre Sequenzen wieder verknüpfen)

3. Primase → synthetisiert kurzen RNA-Primer (nachher von DNA-Pol. I abgespalten)

4. Klammerhalter → erkennt Primer-Template-Übergang & setzt Ringklemme auf

5. Ringklemme (bei Euk. PCNA) → hält DNA-Polymerase auf Template

6. DNA-Polymerase III → fängt an neuen Strang zu synthetisieren

7. Topoisomerase → entwindet die DNA

Topoisomerasen

Enzyme, welche DNA entweder entwinden oder verdrillen.

1. Topoisomerase I: macht single-strand-break → DNA entwindet sich automatisch

2. Topoisomerase II: macht double-strand-break → verhindert Knoten

3. Gyrase: macht Supercoils → spannt DNA

Elongation der Replikation

läuft bidirektional ab: vom OriC in beide Richtungen gleichzeitig. Pro Elternstrang 2 Helikasen & jeweils leading & lagging strand.

Leading strand: kontinuierlich in 3´-Richtung verlängert.

Lagging strand: diskontinuierlich in 3´- Richtung verlängert. Polymerase fällt immer wieder ab & neue Primer müssen erstellt werden → Okazaki-Fragmente entstehen

Termination der Replikation

endet an den Telomeren. Leading strand kann bis zum Ende aufgefüllt werden, bei lagging strand geht Teil verloren ABER Telomerase füllt eigenständig Enden auf (nicht in somatischen Zellen).

Telomerase

Enzym, welches eigenständig Telomer-Enden wieder auffüllt → bringt eigene RNA-Matritze mit & funktioniert wie Reverse Transkriptase (nur in Stamm- & Keimzellen).

Fehlerpaarungskorrektur

wenn Fehler in frischem Strang.

1. wissen, welcher Strang neuer (falscher), weil immer noch Lücken von RNA-Primer drauf

2. MutS → erkennt Fehler, dockt an

3. MutL → bindet an MutS, zieht DNA durch, bis es Lücke findet & schneidet bis Fehler heraus

4. neue DNA-Polymerase III füllt wieder auf

Replikation bei Bakterien

haben zirkuläres Chromosom.

Start → OriC mit AT-reichen Motiven. Daran bindet DnaA, dann Helikase.

Ende → TerC

Kontrolle der Replikation (Eukaryoten)

streng kontrolliert, darf nur 1x pro Zellzyklus stattfinden.

Alle 10.000-100.000 Basen schon Helikasen auf DNA. CDKs (cyclin-dependent-Kinase) phosphoryliert CDCs (cell-division-cycle-Protein) → Bremse, welche dadurch degradieren & Replikation starten lassen.

Reader/Writer

überträgt epigenetische Modifikation von Mutter- auf Tochterzellen (immer nur Hälfte weitergegeben)

Mutationen

nicht nur Replikationsfehler, auch Oxidation, Strahlung…

C → U (leicht behebbar, weil U eigentlich gar nicht in DNA; andere Base (G) muss richtige sein & U wird herausgeschnitten)

methyliertes C → T durch Verlust von NH₂ (nicht so leicht zu beheben, weil nicht eindeutig, welche richtige & welche falsche Base, 50/50). Akkumuliert sich im Laufe der Zeit.

Doppelstrangbruch (zb Höhenstrahlung)

entweder

1. nonhomologous end-joining: Enden einfach wieder zusammengeklebt

oder

2. homologous end-joining: anhand des 2., intakten Chromosoms Information auf gebrochenes überführen (wenn schon mutiert → loss of heterocygocity)

RNA

Ribonukleinsäure (Ribose → 5C Zucker)

aus:

1. Ribose

2. Stickstoffhaltiger Base (A, U, G oder C)

3. Phosphatrest

Uracil wie Thymin, nur ohne Methylgruppe

RNA Faltung

kann sich intern sehr komplex falten → v.a. bei tRNA & Ribosomen, häufig “hairpins”

RNA´s

1. mRNA: messanger, NUR sie codiert

2. rRNA: ribosomale, bildet Ribosomen, katalysiert Translation

3. tRNA: transfer, Adapter zwischen mRNA & AS bei Translation

4. snRNA: small nuclear, spleißt mRNA

5. snoRNA: small nucleolar, modifiziert rRNA

6. miRNA: micro, degradiert körpereigene mRNA

7. siRNA: small interfering, wie miRNA, nur für körperfremde

8. scaRNA: small cajal: modifiziert sn- & snoRNA

rRNA

die ribosomale RNA ist Bestandteil von Ribosomen (60% rRNA, 40% Proteine). Von snoRNA modifiziert.

Bakterien: 70S Ribosomen aus 50S & 30S UE

Eukarya: 80S Ribosomen aus 60S & 40S UE

Ribosomen im Nukleolus synthetisiert (3 von 4 rRNAs auf einem Transkript → Synthese gekoppelt)

tRNA

die transfer RNA vermittelt genetischen Code bei der Translation.

Von oben gegen Uhrzeigersinn:

1. Akzeptor-Arm → hier sitzt AS

2. D-Arm → dockt an Ribosom

3. Anticodon-Arm → drei Basen, die Interaktion mit mRNA vermitteln

4. variable Schleife

5. T-Arm → dockt an Ribosom

mRNA

ist die EINZIGE proteincodierende RNA. Halbwertszeit variabel, korreliert mit Funktion.

von 5´ nach 3´:

1. Cap

2. 5´ UTR (untranslated region) → damit Ribosom bindet

3. Startcodon (AUG)

4. ORF (open reading frame) → codierender Bereich

5. Stoppcodon (UAG, UGA oder UAA)

6. 3´ UTR (untranslated region) → definiert Langlebigkeit & bindet eventuell mit miRNA

7. PolyA-Tail

processing der mRNA

bei Prokaryoten nicht, bei Eukaryoten:

• Cap an 5`-Ende

• Spleißen im ORF

• PolyA-Tail an 3´-Ende

RNA-Polymerasen

Enzym, welches RNA´s synthetisiert

1. RNA-Polymerase I → stellt Ribosomen UE her

2. RNA-Polymerase II → stellt v.a. mRNA her

3. RNA-Polymerase III → stellt v.a. tRNA her

Transkription Bakterien

Initiation:

1. sigma-Faktor erkennt Promotor für zu transkribierendes Gen

2. RNA-Pol. wird von Sigma-Faktor festgehalten & löst sich

→ Transkription startet

Termination:

1. es bildet sich ein Hairpin

→ RNA-Pol. fällt ab

2. oder Rho-Termination, wenn nicht genug NTP´s

Transkription Eukaryoten

Initiation:

1. Transkriptionsfaktoren lagern sich im Bereich des Promotors an

2. TFIIH trennt Doppelstrang auf & phosphoryliert ankommende RNA-Pol.

3. Phosphorylierung führt dazu, dass sich weitere Faktoren für Processing an RNA-Pol. anlagern

4. RNA-Polymerase startet

Elongation:

1. ersten Teil mit Cap versehen

2. ORF spleißen

3. PAP (PolyA-Polymerase) hängt hinten PolyA-Tail an

miRNA

die microRNA kann mRNA degradieren.

1. als Transkript hergestellt

2. bildet hairpin → mit Cap & PolyA

3. unterer Bereich abgeschnitten

4. verlässt Nukleus

5. Dicer entfernt obere Schleife

6. Doppelstrang aufgebrochen

7. Einzelstrang in RISC-Komplex eingebaut

→ tastet jetzt mRNA in 3´ UTR ab, wenn passt blockiert oder degradiert