RNA - biologia molekularna

Jakie mamy rodzaje RNA?

• mRNA - matrycowe

• tRNA - transportujące

• rRNS - rybosomalne

• snRNA - mały jądrowy

• miRNA - mikro

Czym jest miRNA?

populacja cząsteczek RNA o długości 21- 24 nt, które powodują wyciszanie genów (gene silencing)

Co powoduje miRNA?

Negatywnie działa na translacje (hamowanie) lub na stabilność mRNA (degradacja) co powoduje potranskrypcyjne wyciszanie genów

Reguluje rozwój i odpowiedź n warunki fizjologiczne organizmu

U roślin i zwierząt

• mało silnie zachowawczych miRNA

• dużo gatunkowo specyficznych miRNA

Zasady izolacji RNA:

1. Zabezpieczenie materiału przed izolacją

2. Izolacja RNA z tkanek “twardych“

3. Izolacja RNA z hodowli komórkowych

Jak chronimy RNA przed RNAzami zewnętrznymi?

• przygotowanie roztworów do izolacji - kowalencyjnie modyfikuje reszy histydyny, lizyny i argininy

• przygotowanie sprzętu do izolacji oraz pracy z RNA

Jak chronimy RNA przed RNAzami wewnętrznymi?

• niska temperatura (ciekły azot -196°C)

• fenol

• tiocyjanian amonu, guanidyny

• B-merkapentanol

Izolacja RNA z tkanek twardych:

1. Przygotowanie buforu.

   • dodanie buforu do porcji kwaśnego fenolu.

   • w temp. 80°C.

2. Rozdrobnienie tkanki roślinnej w obecności ciekłego azotu do stadium miałkiej mąki.

   • utrzymując cały czas warunki niskiej temp. (dolewanie ciekłego azotu).

3. Przesypanie zmielonego materiału roślinnego do mieszaniny buforu i fenolu (80°C). (Przed przesypaniem wymieszać mieszanine).

4. Przeprowadzić ekstrakcje.

5. Dodać chloroform (równą objętości fenolu czyli - 5 ml).

6. Probówki po zrównoważeniu poddać wirowaniu.

7. Zebrać górną fazę (wodną) i przenieść do nowej probówki.

8. Przeprowadzić ekstrakcje równą objętością chloroformu (etap usunięcia resztek fenolu).

9. Powtórzyć wirowanie.

Po co izolujemy RNA?

• konstrukcja bibliotek

• Northern blot - analiza poziomu ekspresji

• Synteza cDNA i PCR w czasie rzeczywistym - analiza poziomu ekspresji

• Przygotowanie sondy do hybrydyzacji z “macierzą”

Konstrukcja biblioteki cDNA etapy:

1. Całkowity RNA komórkowy

2. Frakcjonowanie całkowitego RNA na złożach z oligo(dT)-celulozą w celu uzyskania mRNA

3. Synteza pierwszej nici cDNA

4. Synteza drugiej nici cDNA

5. Ligacja z adapterem

6. Hydroliza endonukleazą Xhol

7. Ligacja z wektorem

   • pakowanie w otoczki białkowe wirusa

Selekcja klonów biblioteki cDNA

Hybrydyzacja wyznakowaną sondą molekularną DNA

Oddziaływanie z przeciwciałami

Czym jest Northern blot?

Analiza RNA pod względem jakości i ilości poprzez elektroforze w żelu.

Transfer żelu na membranę w polu elektrycznym

Wykrycie określonego RNA przy pomocy sondy molekularnej

Warunki

• denaturujące oby RNA migrowały w zależności of swojego ciężaru

Metody oczyszczania tłuczka (egzogenne)

• lampa UV

• autoklonowanie

• metoda 3-stopniowa

  • detergent

  • etanol

  • woda DEJ°C

Metody endogenne

• ciekły azot (-196°C) spada aktywność enzymów

• dodatki do buforu:

  • Fenol (właściwości denaturujące)

  • tiocyjanian amonu, guanidyny

  • B-merkapentanol

  • EDTA - chelatuje jony metali, które stanowią kofaktory do niektórych enzymów, bez nich nie ma aktywności

Izolacja RNA w kwaśnym (pH=4) fenolu

duża ilość H+

• jony h+ neutralizują ładunki - w DNA:

  • staje się niepolarne

  • rozpuszcza się w fenolu

• jony H+ neutralizują ładunki - w RNA:

  • dzięki aktywności ładunków + RNA pozostaje polarne i rozpuszcza się w wodzie (obecnej w buforze)