NLT - biosensoren

Biosensoren

Klein apparaat dat als resultaat van een biochemische reactie een (afwijkend) meetsignaal geeft.

Syndroom

Ziekteverschijnselen die bij een bepaald ziektebeeld horen.

Biomarker

Stof die objectief iets zegt over het verloop van een bepaald proces. Vaak een eiwit, of RNA-molecuul dat zegt of een gen actief is of niet.

Opbouw eiwit

Aminozuren (totaal 20)

Kenmerken aminozuur

* hoofdketen
* Ene kant van hoofdketen heeft aminogroep (NH2)
* Andere kant van hoofdketen heeft carbonzuurgroep (COOH)
* Variabele restgroep

Condensatie-polymerisatie

Aaneenschakelen van aminozuren. OH van carbonzuurgroep van de een en H van aminogroep van de ander worden afgesplitst en vormen samen water.

Peptidebinding

Aminozuren hebben na condensatiereactie een open binding en binden aan elkaar tussen C- en N-atoom.

Primaire structuur (eiwit)

Volgorde van aminozuren van eiwit (aminozuurfrequentie)

Secundaire structuur (eiwit)

Plaats van aminozuren tov elkaar in driedimensionale elementen.

* α-helix: wenteltrapstructuur, keten draait rondom denkbeeldige as
* β-sheet: plaatvormige ruimtelijke structuur. Gestabiliseert door H-bruggen tussen NH-groep in peptideband.

Tertiaire structuur (eiwit)

Driedimensionale vorm van eiwitketen, afhankelijk van restgroepen.

* apolaire aminozuren: alifatisch, cyclisch, aromatisch
* polaire aminozuren: met O- of S-atoom
* basische aminozuren: NH2-groep als restgroep, lysine, arginine, histidine
* zure aminozuren: COOH-groep als restgroep, asparaginezuur, glutaminezuur

Manieren waarop aminozuur invloed kan hebben op tertiaire structuur van eiwit (waterige omgeving)

* Apolair: hydrofoob
* Polair: hydrofiel: waterstofbruggen
* Cysteïne (SH-groep): disulfidebrug (-S-S-) met H2 als afvalproduct.
* Basisch en zuur: elektrostatische interactie, zuur H-atoom van zuur aminozuur naar basisch aminozuur. COO- van restgroep gaat elektrostatische reactie aan met NH3 van basische restdeel.

Quaternaire structuur

Aantal tertiaire structuren bij elkaar: eiwitcomplex.

Zwangerschapstest

Biomarker: hCG (human Chorion Gonadotroop)

hCG wordt geproduceerd door chorionvlokken zodat gele lichaam in stand wordt gehouden en menstruatie te voorkomen. Deel hCG wordt via nieren uit bloed gefilterd en komt in urine terecht. Vanaf 2 weken na conceptie is concentratie voldoende meetbaar (1e dag menstruatie).

Zwangerschap

Fusie zaadcel en eicel→ zygote via eileider naar baarmoeder. Klompje cellen onderverdelen in trophoblast en embryoblast. Embryo nestelt zich door baarmoederslijmvlies te infiltreren.

Chorionvlokken produceren hCG, voorkomen menstruatie en houden gele lichaam in stand. Gele lichaam produceert progesteron, dat baarmoederslijmvlies intact houdt.

Glucosemeter

Meten bloedsuikerspiegel/concentratie glucose.

Glucose

Eilandjes van Langerhans, α-cellen (glucagon) met daarin β-cellen (insuline).

Insuline zorgt voor omzetting glucose in glycogeen en dat glucose wordt opgenomen in lever→ zakken bloedsuikerspiegel.

Glucagon zet glycogeen om in glucose → stijgen bloedsuikerspiegel.

Antigeen

Ziekteverwekker, kan imuunreactie opwekken

Bijna altijd eiwit met 1+ epitopen waar antistof op kan passen

Antistof

Herkent virus en helpt om deze te bestrijden, specifiek.

Y-vormig, kan aan twee uiteinden binding (epitoop) met antigeen aangaan.

Immunoglobulinen en IgG

Antistoffen laten los van B-lymfocyten.

IgG

IgG bestaat uit 4 polypeptiden: 2 identieke zware ketens en 2 identieke lichte ketens. Door zwavelbruggen gekoppeld tot Y-vormig molecuul.

Fc-gebieden zijn constant en Fv-gebieden zijn variabel doordat aminozuurvolgorde varieert. Unieke structuur past bij 1 epitoop van antigeen

Immunoassay

Laboratoriumtechniek om een kwantitatieve bepaling te doen van de hoeveelheid antigenen in een vloeistof.

Sandwichassay (immunoassay)

2 verschillende antistoffen die binden aan 2 plaatsen van antigeen. Primaire antistoffen aan oppervlak gehecht, oplossing met secundaire antistoffen en kleurstof toegevoegd. Als 2nd antistof aan antigeen met 1st antistof bindt wordt oplossing gekleurd.

Tracer

Deeltje dat meetbaar signaal kan afstaan als binding tussen antistof en antigeen ontstaat.

* Fluorescente groepen: als licht van bepaalde golflengte schijnt, zendt licht van andere golflengte uit.
* Radioactieve tracers: meetbare straling. Korte halfwaardetijd zendt meer straling uit maar vervalt sneller, veiligheid is ook nadeel.
* Magnetische deeltjes
* Enzymen: reactie meetbaar laten verlopen, vergroten reactiesnelheid, vergroten gevoeligheid sensor.

ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

Sandwichassay met enzymen (vaak peroxidasen), zeer gevoelig. Enzym gebonden aan secundaire antistof. Bepaalde kleurstof toegevoegd waardoor enzym na verloop van tijd wordt omgezet in andere kleur. Intensiteit van kleur bepaald hoeveelheid gebonden antigeen.

Verloop zwangerschapstest

Sandwichassay. Aan hCG-molecuul zitten 2 epitopen: α-keten (ook bij hypofysehormoon LHH) en β-keten (specifiek voor hCG).

Strip:

* Losse, gekleurde monoklonale antistoffen tegen β-keten van hCG. Antistoffen kunnen met vloeistof over strip verplaatsen. hCG bindt aan gekleurde antistoffen tot antigeen-antistof-complex.
* Plaats 1: testplaats, monoklonale antistoffen gericht tegen α-keten van hCG. Complex gebonden aan antistoffen tegen α-keten en ontstaat kleuring.
* Plaats 2: controleplaats, monoklonale antistoffen gericht tegen losse gekleurde monoklonale antistoffen. Overige losse monoklonale antistoffen binden, ontstaan kleuring om aan te tonen dat urine verplaatst heeft.

Meting

* Kwalitatief: aanwezigheid biomarker
* Kwantitatief: bepaalde hoeveelheid biomarker

IJklijn

Grafiek die geijkt is door een paar metingen waar het onderlinge verband zichtbaar is gemaakt. Onbekende waarde is te berekenen.

Kwantitatief meten in biosensor

* Te onderzoeken vloeistof gemengd met secundaire antistoffen → labelen antigenen
* Mengsel met gelabelde antigenen wordt aangebracht op oppervlak met primaire antistof
* Gelabelde antigenen hechten via primaire antistof aan oppervlak

Kwantitatief meten in lab

* Primaire antistof aan oppervlak gehecht
* Te onderzoeken vloeistof toegevoegd en antigenen hechten aan primaire antistof
* Antigenen worden gelabeld met secundaire antistof

Kenmerken biosensor

* Biomarker
* Herkenning (specifiek)
* Versnellingskinetiek (snelheid)
* Meetmethode (sensitiviteit)
* Meetwaarde

Gonaden

Geslachtsklieren (eierstokken/teelballen)

Gonadotroop

Hormoon dat op gonaden inwerkt

Waarom zwangerschapstest in de ochtend?

Hoogste concentratie hCG

International Unit (IU) hCG

1 mIU is 0,084 microgram hCG

Diagnose diabetes

* Te hoge concentratie (> 7 mmol/L) glucose na vasten
* Bij drinken van 75g glucose opgelost in water, twee uur later is de glucose concentratie niet onder 11,0 mmol in het bloed gedaald

Sleutel-slot-mechanisme

Door structuren van verschillende eiwitten is er maar 1 combinatie mogelijk. Eiwit is complementair aan ander eiwit, wat zorgt voor een nieuw eiwitcomplex.

Albumine

Eiwit dat belangrijke rol speelt bij regelen osmotische druk in bloed. Bij slecht functionerende nieren stijgt hoeveelheid.

\
* nierziekte microalbuminarie stijgt albumine naar 300mg/1L urine
* nierziekte proteïnurie stijgt albumine naar 500mg/1L urine

Semi-kwantitatief

Niet precies hoeveelheid aanwezige stof bepaalt, wel minimum of maximum

Troponine

Bolvormig eiwit bij spiercontractie en spierrelaxatie.

* Troponine C TnC
* Troponine I TnI
* Troponine T TnT

\
Als spiercel in hart kapot gaat komt troponine in het bloed. Verhoogde concentratie wijst op problemen met het hart.

Waarom problemen met hartspier met TnI en TnT diagnosticeren?

Ruimtelijke structuur van eiwitmolecuul verschilt in hartspier en skeletspier.

Specifiek

Aantal verschillende biomarkers die sleutel-slot-combinatie vormen met biosensor.

Sensitief

Hoeveelheid stof je nodig hebt om hem te kunnen detecteren.

Lymfocyt

Witte bloedcel die lichaamsvreemde stoffen kan herkennen en antistoffen kan maken.

Polypeptide

Eiwitketen

Afweersysteem

* Indringer herkend. Afweersysteem reageert op lichaamsvreemde stoffen (antigenen). Lymfocyt herkent lichaamsvreemde epitopen: epitoop hecht aan receptor lymfocyt.
* Lymfocyten maken specifieke antistoffen. Lymfocyten (B-cellen) gemaakt uit stamcellen. Bij herkenning maakt lymfocyt veel antistoffen voor antigeen.
* Antistoffen binden aan epitoop van antigeen. Interactie tussen moleculen vaakdoor waterstofbruggen en/of aantrekken tussen + en - van moleculen.
* Indringer opgeruimd. Indringer met antigeen-antistof-complex opgegeten door fagocyt: fagocytose.

Antigeen-antistof-complex

Molecuul dat ontstaat als antigeen en antistof aan elkaar binden (sleutel-slot-combinatie)

Fagocyt

Witte bloedcel die lichaamsvreemde stoffen kan verwijderen

Polyklonale antistof

Antistof die door verschillende plasmacellen is gevormd en aan verschillende epitopen kan binden.

Monoklonale antistof

Antistof die door 1 plasmacel is gevormd en aan 1 soort epitoop kan binden.

Klonen

Bepaald type lymfocyten die 1 type antistof produceren laten versmelten met kankercel. Cel ontstaat die 1 soort monoklonale antistof produceert en zichzelf oneindig blijft delen. Monoklonale antistof past specifiek op epitoop van antigeen die plasmacel aanzette tot vorming van antistoffen.

Serum

Vloeistof die antistoffen bevat

Extract van vlees

Extractievloeistof met opgeloste vleesstoffen. Vlees in contact brengen met extractievloeistof waardoor stoffen in vlees oplossen in vloeistof (extraheren).

Doel Ouchterlonytest

Antigenen detecteren (kwalitatief)

Precipitatielijn

Witte lijn die zichtbaar wordt op plaats waar antigeen en antistof binden tot antigeen-antistof-complex.

Principe Ouchterlonytest: aantonen gehakt heeft paardenvlees

Serum met anti-paard-antistoffen: koe inspuiten met extract van paardenvlees waardoor koe anti-paard-antistoffen gaat maken.

Bloed aftappen bij koe en bloed laten stollen. Runderserum met anti-paard-antistof in middelste putje in agar/agarosegel. Serum laten reageren met extract van gehakt, bij neerslag en precipitatielijn hecht anti-paard-antistof met paard-antigenen uit gehakt.

Uitvoering Ouchterlonytest

Glasplaatje met agargel en 4 ronde putjes met even grote afstand. Middelste putje heeft koeienserum met anti-paard-antistoffen. 3 putjes eromheen hebben verschillende antigeenoplossingen: paardenvleesextract, rundvleesextract, gehaktextract.

Eiwitten uit serum diffunderen door gel alle kanten op. Bij antigeen-antistof-complex ontstaat neerslag en precipitatielijn.

Gebeurt langzaam (48 uur), want diffusie van moleculen in agargel duurt lang.

Vorm van precipitatielijnen

* Boemerang: antigenen in buitenste putjes zijn identiek.
* Kruisende lijnen: antigenen niet identiek
* Haakje: gedeeltelijk identiek: kant met haakje meer identiek

Principe immunoassays

Antistoffen met Fc-gebied op vaste ondergrond en toevoegen oplossing met de te onderzoeken antigenen.

Antistoffen binden met Fv-gebied aan antigenen.

Enzym

Eiwit dat bepaalde reactie versnelt als katalysator. Kan niet verbruikt worden of van samenstelling veranderen.

Enzym-substraatscomplex: tijdens reacties verbindt enzym met reactief molecuul, bij ELISA kleurstof die licht geeft bij omzetting door enzym.

Hecht mbv sleutel-slot-mechanisme aan molecuul en keert terug naar oorspronkelijke toestand na reactie.

10^7 omzettingen per seconde.

Bestaan uit aminozuurketen en co-enzymen, vitaminen uit voedsel nodig voor opbouw enzymen.

Peroxidasen

Vaak gebruikte enzymen, doen kleurstof of luminescentie ontstaan.

Magnetisch label

* Magnetisch gemaakte antistoffen kunnen naar het oppervlak getrokken worden met magnetisch veld
* Totaal magnetische deeltjes kan gemeten worden, dus maat voor hoeveelheid aanwezige antistoffen.

Beads

Van antistof voorzien, doorsnede is 1 micrometer. Magnetisch deeltje dat volledig bedekt is met antistoffen.

Nadeel magnetisch deeltje

Deeltjes trekken elkaar aan, klonten ontstaan. Gebruik deeltjes die magnetisch worden als ze zich in een magnetisch veld bevinden: superparamagnetische deeltjes.