1. Characteristics of prokaryotic cells

Prokaryotes ↔ Eukaryotes

Prokaryoten: bact, archaea

• geen celkern: DNA ligt los in cytoplasma in nucleoid

• geen membraangebonden organellen: mitochondriën, GA, …

Eukaryoten: dieren, planten, schimmels, protisten

• celkern: DNA zit in kernmembraan

• membraangebonden organellen

Grootte

De meeste bacteriën: 0,5 tot 2,0 µm

Menselijke rode bloedcel: 7,5 µm

Vorm en indeling

Coccus: rond, groeien + naast elkaar in streep = streptococcus, trosje= staphylococcus

Bacillus: staafje, naast elkaar groeien = streptobacillus

• bv: clostridium tetani (tetanus), lactobacillus bulgaricus (in yoghurt)

Spirochete: kurkentrekkervorm (bv borrelia burgdorferi→ lyme)

Vibrio: komma vorm, gebogen staafje (bv: v. cholerae→ cholera)

Overzicht structuur

Celmembraan, meestal omgeven door celwand

Intern cytoplasma met ribosomen, nucleair gebied, ...

Verscheidenheid aan externe structuren, zoals capsules, flagella en pili

Celwand

Bevindt zich buiten celmembraan

Functies: karakteristieke vorm cel en voorkomt dat cel barst (osmose)

• Cholesterol zorgt CM niet openspringt →fluiditeit: bact heeft dit niet! gevoelig!

• Penicilline of lysozym celwand aantasten

Bestanddelen celwand: peptidoglycaan, buitenmembraan, periplasmatische ruimte

Peptidoglycaan of mureïne

Bevat:

• N-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM)

• Cross linked door tetrapeptiden, met 3de AZ: lysine voor meeste grampos bact, diaminopimelinezuur (DAP) voor meeste gramneg bact

Disacharide-ruggengraat: identiek voor alle bact

Tetrapeptide: L-Alanine →D-glutamic acid →L-lysine/ DAP →D-Alanine

Gramneg versus grampos bact

Gramnegatief: meestal geen oligopeptidebrug, verbinding tussen DAP en D-Ala

Grampositief: oligopeptidebrug, 5 glycinemoleculen (S. aureus)

Grampos bact: celwand

Dikke laag peptidoglycaan: 60-90% celwand bestaat uit peptidoglycaan

Lipoteichoïnezuur en teichoïnezuur

• Polymeren ribitolfosfaat of glycerolfosfaat

• Bezitten neg elektrische ladingen: opp-antigeen, transport Ca2+ en Mg2+

Eiwitten: adhesiefactoren, productie capsule, penicillinebindend eiwit (PBP) in CM

Gramneg bact: celwand

Dunne laag peptidoglycaan: 10-20% celwand bestaat uit peptidoglycaan, verteerd peptidoglycaan levert sferoplasten op (2 membranen)

Periplasmatische ruimte= ruimte tussen cel en buitenmembraan, bevat peptidoglycaan, toxines en katabole enzymen

Eiwitten: adhesiefactoren, productie capsule, penicillinebindend eiwit (PBP) in CM

Gramneg bact: Lipopolysacchariden

of LPS of endotoxine (!)

• buitenste domein: O of somatisch antigeen →samenstelling varieert stam tot stam, serologische classificatie

• kernoligosacharide: 10-15 heptose- en octosesuikers, KDO = keto-deoxyoctulosonaat

• lipide deel: lipide A →gefosforyleerde diglucosamine, meerdere VZ, zoals 3-hydroxy-myristinezuur (C14)

Groot risico: baxter= H2O + zouten + suiker

• + gram neg en pos →door hitte: bact dood (neg en pos dood)→ IV: dier gaat dood

• probleem: bact afgedood →endotoxines zijn hitte stabiel! Shock!

LPS functie

Hecht zich aan specifieke weefsels

Antigene variatie

Beschermende permeabiliteitsbarrière:

• LPS-moleculen en Ca2+

• + EDTA → barrièrefunctie verloren (rol in oordruppels)

bv:hond met oorontsteking: AB geven met hierin EDTA (ethyleen diamine tetra azijnzuur) →zorgt voor Ca wegnemen (binden aan COO- einden) →2 neg ladingen wel afstoten →antennes gaan uit elkaar wijken → AB gemakkelijker binnenkomen

Gramkleuring

Stap 1: kristalviolet 1min →paarskleuring: bevat pos geladen N →binden met iets neg

Stap 2: jood bij gedaan →kristalviolet binden →kristalvioletjood = sterkere kleur en groter molecule

Stap 3: Ontkleuren met ethanol en aceton

• aceton: lipofiel middel, CM kapot maken

• ethanol: denaturatie eiwitten (peptidoglycaanlaag →dichter samenkomen)

• bij gram neg er door, maar niet bij gram pos →dikke laag peptidoglycaan (samengedrukt)

Stap 4: tegenkleuren met safranine →pos geladen

• gram pos: alle plaatsen bezet →oorspronkelijke kleurstof paars

• gram neg: alle kristalviolet weg →kleurt roos

Zuur vaste bact: celwand

= geen grampos en geen gramneg

Dunne laag peptidoglycaan

Arabinogalactanen: verbonden met peptidoglycaan→ verbonden met mycolzuren met hoog moleculair gewicht

Rijk aan lipiden (60% celwand) → LANGZAME GROEIERS !

• Lipoarabinomannanen

• Mycolzuren (C 100, lang)= β-hydroxy-α-alkylvetzuren

Ziehl-Neelsen of zuurvaste kleuring

Eerst kleuren met carbolfuchine

HCl (pH <1) toevoegen: ontkleurt en zuurvaste bact doet niks want gaat niet door celwand

Tegenkleuren: methyleenblauw, zuurvaste blijven eerste kleur behouden

Bacteriën zonder celwand

Mycoplasma

Chlamydia

Archaebacterien

Mycoplasma

Afwezigheid van celwand → pleomorf, vorm aannemen dat die wil

Stabiliteit van celmembraan door opname van sterolen (↔ andere bacteriën)

Zeer klein: 0,2 tot 0,8 µm

Chlamydia

Geen peptidoglycaan

Gramnegatieve bacterie

Obligaat intracellulair !

MOMP = belangrijk buitenmembraaneiwit

Archaebacteriën

Geen peptidoglycaan

Celmembraan: monolaag (40 C lang), ethergebonden (niet fosfolipiden!)

Nucleïnezuren: hittebestendige spiralen

Hittebestendige enzymen: meer hydrofobe AZ, extra bindingen tussen AZ

Archaebacteriën kunnen in extreem barre omstandigheden leven

Celmembraan

Vloeistofmozaïekmodel: fosfolipiden in vl toestand, eiwitten verspreid tussen lipiden→ mozaïekpatroon

Dubbele laag

Eiwitten

Celmembraan functies

Doorlaatbaarheidsbarrière: voorkomen grote stoffen naar buiten

Eiwitanker

Energiebesparing: elektronentransportketen →gradient, vorming ATP

Celmembraan: passief transport

Geen ATP nodig: diffusie doorheen membraan, eiwitkanaal, osmose via water

Celmembraan: actief transport

ATP nodig

Fosfaat zorgen dat het niet terug naar buiten kan gaan

Celmembraan: transport siderophores

Ijzer cofactor

• ijzer 3+ complexeren (graakt niet op zijn eigen goed binnen) →via kanaal binnenkomen → uiteindelijk terecht in cel, ATP nodig →ijzer 3+ omgezet tot ijzer 2+ →in bep enzymes actief

• Ijzer transport van buiten naar binnen

Interne structuren: cytoplasma en nucleoide

Cytoplasma: 80% water en 20% stoffen, zoals ionen en suikers

Nucleaire regio of nucleoïde

• geen kernmembraan! en histon-eiwitten

• bestaat voornamelijk uit DNA, maar ook uit wat RNA en eiwitten

• meeste bact slechts 1 cirkelvormig chromosoom, vibrio cholerae: 2 chromosomen

Interne structuren: Ribosomen

20.000 ribosomen/bacterie, bestaat uit RNA en eiwitten

Functie: eiwitsynthese

Sedimentatiesnelheid in centrifuge

• Svedberg (S)-eenheden: variëren naargelang moleculaire grootte en vorm

• Eukaryoten: snelheid afh van gewicht →versch: niet enkel gewicht telt mee maar ook vorm →verandert: 80s en niet 100s

AB maken dat enkel werkt op ribosomen bact en niet op humane ribosomen →doelwit verschillend van mens – bact

Interne structuren: Inclusions

Korrels: = metachromatische korrels (versch kleurintensiteiten)

• glycogeen (polymeer van glucose): energie

• polyfosfaat (fosfaatpolymeer)

Vesikels: door membranen omgeven structuren

• met gas gevulde vacuolen → fotosynthetische bact en cyanobact

Interne structuren: cytoskelet

Bepaalt vorm van de bacterie

Cytoskelet → bacillus

Geen cytoskelet → coccus

Endosporen

Meest resistente van alle levensvormen (≠ schimmelsporen!)

Om te ontsnappen aan ongunstige omgevingsomstandigheden: uitputting voedingsstoffen, hoge temp, ...

Geslachten (Gram-pos): voornamelijk Bacillus en Clostridium

Endosporen: kieming

= terugkeer naar vegetatieve toestand vanuit spore

Stel slechte omstandigheden: sommige bact omvormen tot endosporen = sporulatie

• septum gevormd en kopie gemaakt van chromosoom

• voorspoor ontstaat: stadium voor dat je endospore krijgt

• 2^de membraan gevormd rond bact chromosoom

• vorming cortex: peptidoglycaanlaag

• vorming proteinen rond cortex: heel stabiel, dikke laag

• dipicolinezuur →watergehalte doen dalen

• rest bact kapot →endospore volledig loskomen (jaren aanwezig blijven)

Dipicolinezuur

Capteert Ca2+

Aanwezig in endospore, maar NIET in vegetatieve bacteriën

Draagt bij aan hittebestendigheid vanwege het zeer lage watergehalte

Externe structuren

Immuunsysteem kan deze structuren herkennen

Flagella, Axial filaments, Pili, Glycocalyx

Flagella

Bestaat uit filament + haak + basaal lichaam: filament → eiwitten (flagelline) in helix

Lengte: 15-20 µm en 20 nm dik

• LM: alleen zichtbaar na kleuring, EM: zichtbaar

Haakflagellum: meestal 90° → “propeller”, energie: protonpomp voor ATP

Grampos: 2 ringen ↔ Gramneg: 4 ringen

Virulentiefactor (H-antigeen)

Flagella soorten

Monotrichous: 1

Amphitrichous: 2, elk aan 1 zijde

Lophotrichous: op 1 plek meerdere flagellen

Peritrichous: 30-40 flagellen

Flagella beweging

Aantrekkende of afstotende stof→ receptoren of transducers→ protonmotieve kracht (energie)→ pos of neg chemotaxis

Bact: glucose naar toe gaan, zwak zuur van weg gaan

Propeller: met klok draaien of tegen klok draaien→ wijzerzin: draaien, tegenwijzerzin: naar voor gaan

Bact snel? Relatief gezien snel (3x sneller dan jachtluipaard proportioneel gezien, niet km/h gezien)

Axial filaments

Spirochetes: Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi

Pili en fimbriae

Samengesteld uit subeenheden eiwit piline

Conjugatiepili of F-pili: overdracht DNA tussen 2 bact (plasmiden), resistentie

Hechtingspili of fimbriae: helpen bact zich aan opp hechten

• virulentiefactor: Neisseria gonorrhoeae → hechting aan epitheelcellen

Virulentiefactor (F-Antigen)

Glycocalyx

= dikke wand polysacchariden rond bact (soms polypeptiden)

Capsule (‘kapsel’): duidelijk afgebakende structuur

• virulentiefactor: beschermt tegen fagocytose (suikers hetzelfde als lichaam)

Slijmlaag (‘slijmlaag’): minder stevig verbonden met celwand

• hecht zich aan en beschermt cel tegen uitdroging

Virulentiefactor (K-antigeen)

Biofilms

=Aan opp gehechte gemeenschappen van bacteriën, omhuld door zelf geproduceerde extracellulaire matrix, die fenotypes aannemen die verschillen van die van planktonische cellen

Planktonische bact: zwemt rond alleen→ genotype hetzelfde, maar fenotype verschilt

• fenotype: minder zuurstof, voedingsstoffen krijgen→ metabool minder actief

Vorming biofilm: bact en schimmels hechten aan biotische en abiotische opp

Stadia biofilmvorming

Quorum sensing

=Hoe bacteriën communiceren, afgifte specifieke signaalmoleculen = auto-inductoren

Lux-systeem in Vibrio fischeri

• Synergie: licht-aanmakende bact en inktvis

• Bact: groeien op inktvis, hebben opp met eten dat voorbijkomt

• Inktvis: licht zorgt dat roofdier moeilijk weet waar inktvis zit →bescherming

Quorum sensing vb

Vibrio →2 bact die genetisch gezien hetzelfde zijn

Bovenaan planktonisch

• Luciferase: luxI →lactone: signaalmoleculen →diffundeert naar buiten

• Niet binden met luxR (regulator): binden met promoter

• Lux niet afgelezen = geen licht

Onderste planktonische bact die in biofilm zit

• LuxI maakt lactone →deel naar buiten, maar door veel bact ook naar binnen komen

• Binden met luxR (regulator) →binden promoter →lux operon aflezen →luciferase = licht

• In community met zoveel bact: samen iets doen →licht maken

Biofilms: toepassingen

Biofilms: infecties bij mensen

Biofilms – overleven als gemeenschap

1) Verminderde penetratie van antimicrobiële middelen

2) Lagere zuurstofniveaus in biofilm

3) Weerstand tegen afweermechanismen van de gastheer

4) Persisters

1) Verminderde penetratie antimicrobiële middelen

Bact in biofilm moeilijk zuurstof, voeding en AB en ontsmettingsmiddelen krijgen

• MIC: min inhiberende concentratie , laagste concentratie die bact groei remt

• Voldoende om kiem inhiberen, MAAR beneden in biofilm lager dan MIC

• Sub-MIC in biofilm verhoogt risico op resistentie-inductie

Pos geladen AB kunnen zich binden aan alginaat

Levende bact met ontsmettingsgroep →heel veel rood, dikke biofilm: groen

2) Lagere zuurstofniveaus in biofilm

Zuurstofgradiënt in biofilm afhankelijk van stroomsnelheid

GFP-gemarkeerde Pseudomonas putida, SYTO-gemarkeerde bacteriën

Centrale celcluster biofilm

• In midden biofilm: bijna 0% zuurstof

• Bact krijgen geen zuurstof en geen voedingsstoffen →slapen

• AB: celwand synthese, eiwit synthese →inwerken op groeiende levende actieve bact

3) Weerstand tegen afweermechanismen van de gastheer

Luchtwegen met gezonde epitheelcellen (lichtblauw) en alveolaire macrofaag (geel)

• Rood bolletje: planktonische cel →opgegeten door macrofaag

• Blauw: biofilmcellen met matrix er rond

• Macrofaag voelt dat er bact zitten dus gaat radicalen en enzymes aanmaken →maakt zich klaar om bact dood te maken MAAR kan er niet door

• Radicalen vrijkomen en reageren met eigen cellen = gefrustreerde fagocytose

4) Persisters

AB toevoegen: bact afdoden →verwachten helemaal op x as MAAR is niet

Plateau fase:

• Waarom blijven? →resistent: isoleren →terug opgroeien zonder AB →AB hierna toevoegen: bact niet afgedood →verhogen zelfs

• Persistes: resistent maar slapen beetje: isoleren →terug opgroeien zonder AB →AB hierna toevoegen: bact afgedood voor deel

Huidige strategieën tegen biofilms

Preventie: regelmatige reiniging en desinfectie, volledige preventie vrijwel onmogelijk

Behandeling en verwijdering van biofilms: Sterilex®

Verwijdering geïnfecteerd apparaat: laatste optie

Cystische fibrose

Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia

Kanaal Cl ionen in lumen brengen, als kanaal defect→ dikke mucus

• Taai slijm: ideale omgeving bact om zich te verstoppen en moeilijk te behandelen

• Heel snel en gemakkelijk luchtweginfecties