la replicazione del DNA

Cos’è il DNA e quale funzione svolge?

Il DNA è la molecola che custodisce l’informazione genetica, trasmessa di generazione in generazione. Deve garantire sia la fedeltà della trasmissione sia la possibilità di introdurre variazioni, alla base della diversità biologica e dell’evoluzione.

Perché la variabilità genetica è importante?

Le mutazioni, selezionate nel tempo, rappresentano la base dell’evoluzione. Esse generano nuove caratteristiche che possono migliorare l’adattamento e la sopravvivenza di una specie.

Cos’è la replicazione semiconservativa?

È il meccanismo in cui la doppia elica si divide rompendo i legami idrogeno tra i filamenti: ogni filamento funge da stampo per sintetizzare un nuovo filamento complementare. Alla fine, ciascuna molecola di DNA è formata da un filamento “vecchio” e uno “nuovo”.

Quali altri modelli di replicazione erano ipotizzati?

• Conservativo: i due filamenti originali rimangono insieme; si forma una doppia elica “vecchia” e una “nuova”.

• Dispersivo: ogni molecola figlia contiene segmenti alternati di DNA vecchio e nuovo.

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Che cosa dimostrò l’esperimento di Meselson e Stahl (1958)?

dimostrò che la replicazione del DNA avviene secondo il modello semiconservativo. I batteri coltivati in un isotopo pesante di azoto (^15N) trasferiti in terreno con azoto leggero (^14N) mostrarono, dopo una divisione, una densità intermedia del DNA. Dopo ulteriori divisioni, apparvero due bande corrispondenti a DNA leggero e intermedio, confermando il modello semiconservativo.

Come funziona l’esperimento di Meselson e Stahl?

• Crescita di batteri in ^15N → DNA pesante.

• Trasferimento in ^14N → replicazione del DNA.

• Analisi del DNA mediante centrifugazione in gradiente di densità → osservazione delle bande di DNA con densità diverse a seconda del numero di generazioni.

Qual è il significato biologico della replicazione semiconservativa?

Garantisce la trasmissione fedele dell’informazione genetica, permettendo alle cellule di duplicare il proprio DNA mantenendo continuità tra le generazioni.

Come viene assicurata la precisione della replicazione?

Esistono sistemi di correzione e riparazione del DNA che correggono errori di copia e riparano danni, mantenendo la stabilità genomica e proteggendo l’informazione genetica nel tempo.

Dove inizia la replicazione del DNA?

In corrispondenza di specifiche sequenze chiamate origini di replicazione. Queste sequenze sono siti particolari dove la doppia elica si apre per iniziare la duplicazione.

Qual è la caratteristica dell’origine di replicazione nei batteri?

Nei batteri, il genoma è generalmente una singola molecola circolare di DNA e presenta un solo sito di origine (ad esempio, il genoma di Escherichia coli ha circa 245 paia di basi in origine di replicazione).

Qual è la proteina chiave per l’inizio della replicazione nei batteri?

DnaA, che riconosce la sequenza dell’origine e destabilizza localmente la doppia elica in una zona ricca di basi A-T, più facili da separare per via dei soli due legami idrogeno.

Come avviene l’inizio della replicazione nei cromosomi eucariotici?

Gli eucarioti aprono la doppia elica in numerosi punti detti repliconi. Ogni cromosoma ha centinaia di origini di replicazione, attivate secondo uno schema temporale e spaziale specifico della cellula.

Cos’è il licensing factor e qual è il suo ruolo?

È una proteina sintetizzata solo durante la fase G1 del ciclo cellulare, che permette alle proteine del complesso ORC(Origin Recognition Complex) di posizionarsi sull’origine di replicazione. Garantisce che ogni origine venga utilizzata una sola volta per ciclo cellulare.

Come viene impedita la riattivazione delle origini di replicazione?

Dopo l’inizio della replicazione, i licensing factors vengono degradati o espulsi dal nucleo, evitando che la stessa origine sia riutilizzata nello stesso ciclo cellulare.

Quale enzima separa i due filamenti della doppia elica?

Le elicasi legate al DNA del complesso ORC, che utilizzano energia da ATP per aprire progressivamente la doppia elica.

Cosa sono le forcelle di replicazione?

Strutture a forma di Y formate durante la separazione dei filamenti di DNA, che permettono alla replicazione di procedere in direzioni opposte (replicazione bidirezionale).

Qual è il ruolo delle proteine SSB (Single-Strand Binding) nella replicazione?

Si legano ai filamenti a singolo DNA per impedire la riformazione della doppia elica, stabilizzando la struttura durante la replicazione.

Cos’è il primosoma?

Complesso formato da elicasi e primasi. La primasi è un RNA polimerasi che sintetizza un primer di RNAcomplementare al filamento stampo, indispensabile per iniziare la sintesi del DNA

Perché si usa un RNA primer nella replicazione?

Perché le DNA polimerasi non possono iniziare la sintesi ex novo. L’RNA primer fornisce un’estremità 3’-OH libera. Inoltre, minimizza errori iniziali, ma viene poi sostituito con DNA per correggere eventuali imprecisioni.

Qual è il significato biologico dell’apertura controllata del DNA?

Garantisce che la replicazione sia accurata, coordinata e avvenga una sola volta per ciclo cellulare, preservando l’integrità del genoma.

Qual è la funzione principale delle DNA polimerasi?

Le DNA polimerasi catalizzano la polimerizzazione del DNA, aggiungendo nucleotidi complementari al filamento stampo. La reazione avviene tramite la formazione di un legame fosfodiesterico tra il gruppo 3′-OH dell’ultimo nucleotide del filamento in crescita e il gruppo fosfato 5′ del desossiribonucleoside trifosfato (dNTP). Questa reazione comporta due idrolisi:

1. Produzione di pirofosfato e desossiribonucleoside monofosfato.

2. Idrolisi del pirofosfato, liberando energia.
   Questa energia alimenta anche altri processi della replicazione.

in che direzione procede la sintesi del DNA e perché?

La sintesi procede sempre in direzione 5′→3′ perché le DNA polimerasi possono aggiungere nucleotidi soltanto a un’estremità 3′-OH libera del filamento in crescita. Questo vincolo è dovuto alla chimica del legame fosfodiesterico.

Qual è il criterio per l’aggiunta di un nucleotide durante la replicazione?

Il nucleotide aggiunto deve essere complementare alla base del filamento stampo. Le DNA polimerasi possiedono una specificità di appaiamento grazie ai legami idrogeno tra basi complementari (A–T e G–C).

Velocità di sintesi del DNA in procarioti ed eucarioti?

• E. coli (DNA Pol III): circa 1000 nucleotidi/sec.

• Cellule umane coltivate in vitro: circa 60–90 nucleotidi/sec.
  Nonostante la velocità inferiore, le cellule eucariotiche compensano con molteplici origini di replicazione.

Cos’è l’attività esonucleasica 3′→5′?

È una funzione di correzione di bozze. Se la DNA polimerasi inserisce un nucleotide errato, la sintesi si arresta. L’enzima torna indietro, rimuovendo il nucleotide sbagliato grazie alla sua attività esonucleasica, prima di riprendere la sintesi. Questa funzione riduce enormemente il tasso di errori della replicazione (≈1 errore ogni miliardo di nucleotidi).

Quali DNA polimerasi sono presenti in E. coli e qual è il loro ruolo?

• DNA Pol III: sintesi principale del DNA durante la replicazione.

• DNA Pol I: rimozione dei primer RNA, riparazione del DNA.

• DNA Pol II, IV, V: riparazione del DNA e bypass di lesioni.

• Tutte tranne Pol V hanno attività esonucleasica 3′→5′.

Qual è il ruolo del complesso primasi/polimerasi α nelle cellule eucariotiche?

Il complesso primasi/polimerasi α sintetizza:

1. Un primer RNA (5–10 nucleotidi).

2. Un breve tratto di DNA (~20–30 nucleotidi) che costituisce il punto di partenza per la DNA polimerasi δ o ε.

Come vengono rimossi i primer RNA nella replicazione eucariotica?

1. RNasi H: rimuove l’RNA primer che forma un ibrido RNA–DNA.

2. FEN-1 (Flap EndoNuclease): rimuove eventuali porzioni a “flap” di RNA o DNA.
   Questi processi lasciano un’estremità 3′-OH libera per la DNA polimerasi.

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Ruolo di RF-C e PCNA nella replicazione eucariotica?

• RF-C (Replication Factor C): attiva il fattore di processività.

• PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen): forma un anello attorno al DNA che mantiene la DNA polimerasi legata al filamento stampo, aumentando la velocità e la processività della sintesi.
  Agiscono insieme per sostituire il complesso primasi/polimerasi α con DNA polimerasi δ o ε.

Cosa sono le TLS (Translesion Synthesis Polymerases)?

DNA polimerasi specializzate che possono replicare DNA danneggiato senza attendere la riparazione. Sono essenziali per la sopravvivenza in condizioni di stress genotossico. Negli eucarioti sono molte, mentre nei batteri funzioni analoghe sono svolte da Pol IV e V.

Cos’è la replicazione semidiscontinua del DNA?

È il processo mediante il quale la duplicazione del DNA avviene in modo differente sui due filamenti stampo a causa della loro antiparallelità.

• Un filamento (leading strand) viene sintetizzato continuamente nella stessa direzione di avanzamento della forcella di replicazione.

• L’altro filamento (lagging strand) viene sintetizzato discontinuamente, in brevi frammenti chiamati frammenti di Okazaki.

Perché il filamento lagging è sintetizzato in modo discontinuo?

Poiché la DNA polimerasi sintetizza il DNA solo in direzione 5’→3’, il filamento stampo orientato 3’→5’ costringe la sintesi a procedere a ritroso rispetto alla forcella di replicazione, generando frammenti separati che poi vengono uniti.

Chi ha scoperto i frammenti di Okazaki e quando?

R. Okazaki nel 1968, osservando in E. coli che dopo brevi esposizioni alla timidina triziata si ottenevano frammenti di DNA lunghi 1000-2000 nucleotidi inizianti con brevi sequenze di RNA.

Qual è il ruolo della primasi nella replicazione del filamento lagging?

Sintetizza brevi primer di RNA ripetutamente lungo il filamento stampo, necessari per iniziare la sintesi di ogni frammento di Okazaki.

Come viene rimosso l’RNA primer e sostituito con DNA?

• DNA polimerasi I (nei procarioti) rimuove i nucleotidi di RNA tramite attività esonucleasica 5’→3’ e contemporaneamente li sostituisce con DNA (attività di polimerizzazione).

• Anche DNA polimerasi II può partecipare a questa attività.

Qual è il ruolo della DNA ligasi?

Unisce i frammenti di Okazaki, formando legami fosfodiesterici tra il nuovo DNA e il frammento precedente.

Cos’è il modello ad ansa di replicazione?

Meccanismo in cui la DNA polimerasi III sintetizza contemporaneamente entrambi i filamenti grazie a un ripiegamento temporaneo del filamento lagging in una struttura ad ansa, permettendo coordinamento tra sintesi continua e frammentata.

Cosa accade al DNA a valle della forcella di replicazione?

Il DNA si super-spiralizza per la torsione necessaria a separare i filamenti, generando tensione che può bloccare l’avanzamento della replicazione.

Qual è il ruolo delle topoisomerasi?

Alleviano la tensione del DNA tagliando temporaneamente uno o entrambi i filamenti e ricongiungendoli:

• Topoisomerasi I: taglia un filamento.

• Topoisomerasi II (girasia nei batteri): taglia entrambi i filamenti e riduce costantemente la tensione.

• La girasi è essenziale per permettere la replicazione; la sua inibizione blocca il processo.

Cos’è la regione ter nei batteri?

È la regione del cromosoma batterico dove le due forcelle di replicazione si incontrano e completano la duplicazione, formando una struttura detta theta.

Come si struttura il DNA negli eucarioti?

Il DNA si associa a proteine istoniche formando i nucleosomi, che sono le unità fondamentali dei cromosomi.

• Ogni nucleosoma è formato da un ottamero di istoni: due copie ciascuno di H2A, H2B, H3, H4.

Cosa succede ai nucleosomi durante la replicazione del DNA?

Devono dissociarsi temporaneamente per consentire il passaggio della forcella replicativa.

• Il nucleo istonico si separa in:

  • Un tetramero H3-H4

  • Due dimeri H2A-H2B

Come avviene il riassemblaggio dei nucleosomi sui filamenti di DNA neo-sintetizzati?

Dopo il passaggio della forcella replicativa:

1. Il tetramero H3-H4 parentale viene trasferito direttamente a uno dei due filamenti di DNA replicato, costituendo la base iniziale per il nucleosoma.

2. Un dimero H2A-H2B parentale si unisce ai dimeri H2A-H2B neo-sintetizzati provenienti da un pool di nuova sintesi, completando l’assemblaggio.

Da dove provengono gli istoni per il nuovo assemblaggio?

• Dimeri H2A-H2B e tetrameri H3-H4 di nuova sintesi vengono prodotti durante la fase S del ciclo cellulare, in coordinamento con la sintesi del DNA.

• Questi istoni si aggiungono ai componenti parentali per formare nucleosomi comp

Quali combinazioni di istoni si possono avere nei nucleosomi neoformati?

Possono avere configurazioni miste:

• Tetramero H3-H4 parentale + dimeri H2A-H2B parentali

• Tetramero H3-H4 parentale + dimeri H2A-H2B di nuova sintesi

• Tetramero H3-H4 di nuova sintesi + dimeri H2A-H2B di nuova sintesi

• Combinazioni miste di entrambe le origini.

Quali proteine regolano l’assemblaggio dei nucleosomi?

Proteine chaperoni istonici, che:

• Stabilizzano gli istoni durante il trasporto

• Guidano il corretto posizionamento sulle doppie eliche di DNA

• Facilitano la riorganizzazione transitoria della cromatina.
  Esempi: ASF1, CAF-1, FACT.

Perché è importante il riassemblaggio dei nucleosomi?

• Mantiene la struttura della cromatina dopo la replicazione

• Preserva l’informazione epigenetica del genoma, assicurando un equilibrio tra istoni parentali e di nuova sintesi.

Quando avviene la sintesi degli istoni?

Principalmente durante la fase S del ciclo cellulare, in stretta coordinazione con la duplicazione del DNA.

os’è il “problema della replicazione” nei cromosomi lineari?

Nei cromosomi lineari, la replicazione non può completare la sintesi dell’estremità 5′ del filamento lagging, perché la rimozione dell’innesco di RNA genera una lacuna che non può essere riempita dalla DNA polimerasi. Questo porta a un progressivo accorciamento del DNA terminale ad ogni ciclo di replicazione.

Cos’è il telomero?

Il telomero è una sezione terminale dei cromosomi lineari costituita da sequenze ripetute non codificanti (es. TTAGGG nei vertebrati) che formano una sorta di “cap” protettivo per il DNA codificante.

• Ha un’estremità sporgente al 3′.

• Protegge il cromosoma da degradazione, fusione o riconoscimento come DNA danneggiato.

Quali complessi proteici proteggono i telomeri?

Il complesso Shelterin, formato da 6 proteine, che:

• Protegge l’integrità dei telomeri

• Regola la struttura telomerica

• Previene la fusione dei cromosomi.

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Che cosa succede all’estremità 3′ del telomero durante la replicazione?

L’innesco di RNA presente all’estremità 5′ del filamento lagging viene rimosso, lasciando una lacuna. Questo provoca l’accorciamento progressivo del telomero, fenomeno noto come accorciamento telomerico.

Cos’è la senescenza replicativa?

È lo stato in cui una cellula entra quando i telomeri diventano troppo corti (oltre il limite di Hayflick).

• Arresto totale del ciclo cellulare

• Metabolismo ridotto

• Ridotta sintesi proteica

• Secrezione di fattori di senescenza
  È un meccanismo di protezione contro il danno genetico.

Qual è il ruolo della telomerasi?

La telomerasi è un enzima ribonucleoproteico che allunga i telomeri, compensando l’accorciamento dovuto alla replicazione.

• Scoperta da Blackburn e Greider nel 1989

• Premio Nobel per la Medicina 2009

• Presente in cellule germinali, staminali embrionali e alcune cellule tumorali.

Qual è la composizione della telomerasi?

• TERT: componente proteica (Telomerase Reverse Transcriptase)

• TERC: componente RNA (Telomerase RNA Component), che funge da stampo complementare alle sequenze telomeriche.

Come funziona la telomerasi?

1. L’estremità 3′ sporgente del filamento di DNA si appaia con la sequenza complementare presente in TERC.

2. La telomerasi utilizza l’RNA come stampo per sintetizzare nuove sequenze telomeriche (TTAGGG nei vertebrati).

3. Il processo è ciclico: la telomerasi si sposta lungo il filamento e ricomincia la sintesi.

4. Una DNA polimerasi DNA-dipendente completa la sintesi del filamento complementare anti-senso.

• Alla fine, l’estremità 3′ rimane sporgente, ma il telomero è stato allungato.

Cos’è il t-loop e il D-loop?

Strutture di ripiegamento del telomero:

• t-loop: estremo del telomero ripiegato su sé stesso a protezione.

• D-loop: regione interna di appaiamento all’interno del t-loop, parte della protezione cromosomica.

Qual è la differenza nell’attività della telomerasi tra cellule germinali e somatiche?

• Cellule germinali e staminali embrionali: alta attività telomerasica → replicazione indefinita.

• Cellule somatiche: attività telomerasica molto bassa o assente → accorciamento progressivo dei telomeri → senescenza replicativa.

Quali implicazioni ha l’attività della telomerasi?

• Longevità cellulare: mantenimento dei telomeri.

• Patologie legate all’invecchiamento: riduzione dell’attività telomerasica → senescenza precoce.

• Tumori: iperattivazione della telomerasi → proliferazione illimitata delle cellule tumorali.

• Terapia anti-cancro: la telomerasi è un possibile bersaglio terapeutico.

Che cos’è PCNA e perché è importante?

PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) è una proteina nucleare scoperta nel 1978, definita "antigene nucleare delle cellule proliferanti".
Funzione principale: agisce come sliding clamp — un anello che avvolge il DNA per garantire un’elevata processività delle DNA polimerasi durante la replicazione, soprattutto nella fase S del ciclo cellulare.

Qual è la struttura di PCNA?

PCNA è un omotrimero — formato da tre subunità identiche che creano un anello scorrevole attorno al DNA.
Questa struttura permette alle polimerasi di sintetizzare DNA in modo continuo e accurato.

Come viene caricato PCNA sul DNA?

PCNA viene caricato sul DNA grazie a Replication Factor C (RFC), in un processo ATP-dipendente.
RFC apre il trimero di PCNA e lo posiziona sulle regioni di DNA a singolo filamento vicino alla forcella replicativa.

Qual è il ruolo di PCNA nella replicazione del DNA?

• Recluta le DNA polimerasi:

  • Polimerasi ε → filamento leading

  • Polimerasi δ → filamento lagging

• Coordina il riassemblaggio della cromatina dopo la replicazione.

PCNA ha un ruolo nella riparazione del DNA?

Sì. PCNA funge da impalcatura per vari sistemi di riparazione:

• Riparazione per escissione di basi (BER)

• Riparazione per escissione di nucleotidi (NER)

• Riparazione dei mismatch (MMR)

Viene regolato anche tramite ubiquitinazione su residui come K164, che lo coinvolge nella sintesi translesionale (TLS).

Come PCNA regola il ciclo cellulare?

PCNA interagisce con ciclina D. Il complesso ciclina D–CDK4/6 fosforila la proteina Rb, liberando E2F, che avvia la sintesi dei geni della fase S.
Il legame di PCNA alla ciclina D impedisce una precoce sintesi di DNA in fase G₁.
Durante G₁→S, la riduzione della ciclina D libera PCNA per la replicazione.

Qual è il rapporto tra PCNA e p21?

In presenza di danno al DNA, p53 induce la sintesi di p21.
p21 lega PCNA, bloccando la sintesi di DNA per permettere la riparazione o attivare l’apoptosi se il danno è irreparabile.

Perché PCNA è un marcatore importante?

L’espressione di PCNA è ciclica, con picco nella fase S, quindi è un indicatore di proliferazione cellulare.
Nei tumori, PCNA è spesso sovraespresso, associato a replicazione intensa e instabilità genomica. Questo lo rende un potenziale bersaglio terapeutico.