D4H4 - MICROSCOPIE

principe microscoop

• object

• I_o(bjectief) ; gevormd door objectieflens (projector) met kleine brandpuntafstand (hoe kleiner, hoe beter)

• I_e(yepiece) ; gevormd door oculairlens (vergrootglas)

vergroting microscoop (m)

• vergroting objectief

• vergroting oculair

• product 2 vergrotingen; m = m_{o *} m_e

vergroting objectief (m_o)

• via dunne-lenzenformule

• 1/f_o = 1/p_o + 1/i_o

• m_o = -i_o/p_o = 1 - i_o/f_o

vergroting oculair (m_e)

• via dunne-lenzenformule

• 1/f_e = 1/p_e + 1/i_e

• m_e = -i_e/o = 1 - i_e/f_e

alternatieve formules

• m = m_o* m_e = (1 - i_o/f_o ) * (1 - i_e/f_e ) = i_oi_e/f_of_e

• met i_e ≈ -N (nabijheidspunt ≈ 25cm)

• m = - i_oN/f_of_e

praktische toepassing

lichtmicroscoop

• Köhler belichting; beter contrast + resolutie

• objectief; zeer kleine brandpuntafstand

  • NA = nsinα (numerieke apertuur; hoe hoger, hoe beter resolutie)

  • n = brekingsindex medium tussen lens en preparaat

  • α = halve hoek

numerieke apertuur

• waarde die aangeeft hoe goed een optisch systeem, zoals een lens, licht kan verzamelen en details kan onderscheiden

• hoe hoger deze waarde, hoe beter

gebruik immersie-olie

• n_{immersie-olie} = 1.52

• n_lucht = 1

• NA = nsinα

• hoe groter NA; hoe beter resolutie

resolutie objectief (bew)

resolutie objectief (s)

• θ_min = s/d → s = θ_min d = 1.22*(d/D)*λ

• violet licht vs rood licht

  • resolutie; kleiner vs groter

  • kwaliteit; hoger vs lager

• we gebruiken dus best blauw licht

resolutie en numerieke apertuur

• 0.61*(λ/NA)

• hoe groter NA, hoe kleiner resolutie dus hoe hoger de kwaliteit zal zijn

soorten objectieven

• achromaten

• apo-achromaten

• aplanaten = plan-objectieven

• plan-apo (beste)

achromaten

• gecorrigeerd voor chromatische aberraties

• enkel rood en blauw

apo-achromaten

• sterk gecorrigeerd voor chromatische aberraties

• alle kleuren

aplanaten = plan-objectieven

• gecorrigeerd voor beeldvlakkromming

plan-apo

• gecorrigeerd voor zowel chromatische aberraties (bij elke klaur) als beeldvlakkromming

• beste lenzen

condensor

• concentreert het licht op een klein gebied van het preparaat

• apo-chromatische lens (≠ apo-achromatisch) genomen om aberraties te vermijden

• regeling apertuur (≠ NA) met diafragma

oculair

• vergroot het beeld gevormd door het objectief

• meestal 10x

• meetplaatje kan geschoven worden tussen veldlens en ooglens

soorten microscopen

• invert

• fase-contrast

• fluorescentie

• confocale

• elektronen

invert — samengevat

fase-contrast — samengevat

fase contrast — opstelling

• vb λ/4 fasverschil door specimen

• is steeds afhankelijk van soort specimen, van de brekingsindex

• bedoeling om ons faseverschil zo dicht mogelijk bij λ/2 te krijgen zodat ons contrast maximaal is

fase contrast — werking

• maakt kleine faseverschillen zichtbaar door ze om te zetten in verschillen in helderheid = contrast

• 2 lichtsoorten

  • ongebroken licht; wordt niet beïnvloed door preparaat

  • diffractie- of gebroken licht: wordt afgebogen door preparaat

• gevolg; faseverschil tussen de twee stralen, vb. λ/4

fase contrast — werking

• beide komen samen in faseplaat v/h objectief

• faseplaat = gecoate glasplaat; absorbeert licht + versterkt de verschillen tussen het gebroken en ongebroken licht door extra faseverschuivingen toe te voegen, vb. λ/4

• doel; totale verschuiving moet zo dicht mogelijk λ/2 benaderen zodat 2 soorten golven in tegenfase zijn

• destructieve interferentie → duidelijke helderheidsverschillen; donker gebied tegen een heldere achtergrond

fluorescentie — samengevat

fluorescentie — opstelling

fluorescentie — werking

• lichtbron

  • kwiklamp (tegenwoordig eerder LED)

• excitatiefilter

  • laat enkel licht door in excitatiegolflengtegebied van fluorochroom (vb. blauw) → wekt fluorescentie op in het preparaat

• dichroïsche spiegel / prisma

  • weerkaatst licht naar specimen

  • laat emissiegolflengte van fluorochroom door naar oculair (vb. DAPI, groen)

• emissiefilter

  • licht van excitatiegolflengte wordt geblokkeerd

  • licht van de emissiegolflengte wordt doorgelaten

confocale — samengevat

confocale — opstelling

confocale — werking

• ± fluorescentie microscoop

• lichtbron

  • laserbundel (krypton, argon) met zeer kleine divergentie

• dichroïsche spiegel

  • weerkaatst licht naar specimen

  • laat emissiegolflengte van fluorochroom door naar detector (vb. DAPI, groen)

• confocale opening

  • filtert licht weg dat niet afkomstig is van de exacte focuslaag (licht afkomstig uit boven- of onderliggende lagen)

  • zet emissielicht om in elektrische spanningspuls evenredig met de intensiteit

• beeldvorming

  • detector + software op basis van de x-y distributie van het intensiteitssignaal

elektronen — samengevat

elektronen — opstelling